《Fishes》：Precision, Reproducibility, and Validation in Zebrafish Genome Editing: A Critical Review of CRISPR, Base, and Prime Editing Technologies
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这篇综述批判性地审视了CRISPR、碱基编辑（BE）和先导编辑（PE）技术在斑马鱼模型中的应用进展与挑战。文章强调，尽管核糖核蛋白（RNP）递送、PAM（前间隔序列邻近基序）灵活的Cas变体及精准编辑器等技术提升了编辑准确性并减少了嵌合体，但嵌合现象、等位基因复杂性及可变的种系传播仍是常见挑战。作者指出，实验设计需在F0（零代）表型筛选的快速性与稳定品系生成的严谨性之间权衡，并呼吁采用包括多组学验证在内的标准化流程以提升可重复性，从而更可靠地将斑马鱼用于功能基因组学与疾病研究。
斑马鱼基因组编辑技术演进：从ZFNs到精准编辑器
斑马鱼（Danio rerio）因其胚胎透明、与人类遗传相似度高、适合大规模筛选等优势，已成为功能基因组学和疾病研究中的重要脊椎动物模型。基因组编辑技术的飞速发展，特别是CRISPR及其衍生工具的出现，极大地推动了该模型的应用。本综述将系统回顾斑马鱼基因编辑技术的发展，并重点讨论其精准性、可重复性及验证方面的挑战与对策。
早期编辑工具：ZFNs与TALENs
锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）是斑马鱼中最早成功应用的 programmable 核酸酶。它们通过将可定制的DNA结合模块与非特异性核酸酶结构域耦合，实现位点特异性双链断裂（DSB）。然而，这两种技术因其蛋白质工程设计繁琐、靶点特异性依赖上下文、可变脱靶活性以及有限的多重或高通量应用潜力，现已基本被CRISPR系统所取代。它们的主要贡献在于为RNA引导的CRISPR系统铺平了道路，后者通过简化的设计、更高的灵活性及提升的实验通量克服了诸多限制。
CRISPR-Cas9：精准基因组编辑的革命
CRISPR-Cas（成簇规律间隔短回文重复序列-CRISPR相关系统）技术，特别是CRISPR-Cas9，自2012年发现以来，彻底改变了斑马鱼及其他模式生物的基因编辑格局。该系统利用单链引导RNA（sgRNA）将Cas9核酸酶导向基因组特定位点进行切割，其简便性、成本效益以及高诱变效率使其成为主流工具。Cas9通常在原型间隔序列邻近基序（PAM）序列（如NGG）上游切割DNA，产生DSB。细胞主要通过两种途径修复DSB：易出错的非同源末端连接（NHEJ）常导致小片段的插入或缺失（indels），从而实现基因敲除；而精度较高的同源指导修复（HDR）则可用于精确的基因插入或序列校正，但在斑马鱼早期胚胎中效率较低且不稳定。
尽管CRISPR-Cas9潜力巨大，但其依赖易错的NHEJ修复、可能产生脱靶DSB以及难以实现精确编辑结果等局限性，催生了更先进的编辑技术。
先进CRISPR技术：碱基编辑与先导编辑
为克服传统CRISPR的局限，碱基编辑（BE）和先导编辑（PE）技术应运而生，它们能够在不断裂DNA双链的情况下实现更精确的编辑。
碱基编辑（BE）利用催化活性受损的Cas9蛋白（dCas9或切口酶Cas9n）与胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶融合，实现精确的单核苷酸转换。胞嘧啶碱基编辑器（CBE）将胞嘧啶（C）转换为尿嘧啶（U），最终导致C-to-T的转变；腺嘌呤碱基编辑器（ABE）则将腺嘌呤（A）转换为次黄嘌呤（I），最终导致A-to-G的转变。优化后的编辑器如zevoCDA1-BE4max、zhyA3A-CBE5等已在斑马鱼中展示了较高的编辑效率（某些情况下可达99.33%）和较低的indel率，并具有PAM灵活性（如SpRY变体）。
先导编辑（PE）则更为灵活，它使用Cas9切口酶与工程化逆转录酶融合的蛋白，在pegRNA（先导编辑引导RNA）的指导下，通过逆转录直接将所需编辑写入基因组DNA，能够实现碱基替换、小片段插入或缺失，而无需供体DNA模板。研究表明，优化后的PE系统（如PEmax, PE7）在斑马鱼中能够实现点突变、缺失和插入等多种精确编辑。
实验流程与关键考量
斑马鱼基因编辑的成功应用依赖于严谨的实验流程。
组件设计与递送：gRNA的设计至关重要，需考虑靶点特异性、GC含量、避免多聚T序列等。计算工具（如GuideScan2, CRISPRon/off）可辅助设计，但体内外预测存在差异，需实验验证。递送方法主要包括显微注射（最常用）、核糖核蛋白（RNP）复合物注射（可减少脱靶和DNA整合）、质粒递送以及电穿孔。RNP递送因其编辑活性快、潜在脱靶风险低而日益受到青睐。
后期处理与验证：编辑后的斑马鱼需要在严格控制水温（28.5 °C）、pH、光照周期等条件的标准化饲养环境下培育。突变筛选和基因分型可采用高分辨率熔解曲线分析（HRMA）、T7内切酶I（T7EI） assay、限制性片段长度多态性（RFLP）以及桑格测序或下一代测序（NGS）。种系传播筛查通过将F0代与野生型斑马鱼杂交并分析F1代基因型来完成。嵌合体（同一生物体内存在不同基因型的细胞）和脱靶事件的检测至关重要，通常需要深度测序或全基因组测序来准确评估。严谨的验证是避免错误解读基因型-表型关系的关键。
应用领域广泛
斑马鱼基因编辑技术已广泛应用于多个研究领域。
基础生物学研究：用于研究基因功能、发育过程（如心血管形成、造血作用）、转录调控（利用dCas9融合转录激活/抑制因子进行CRISPRa/i）和表观基因组编辑，以及通过活体成像和谱系追踪技术（如GESTALT）实时观察细胞命运。
疾病建模与药物发现：超过80%的人类疾病基因在斑马鱼中有直系同源物，使得斑马鱼成为模拟神经疾病、癌症、心血管病、代谢性疾病等的有力模型。结合高通量筛选（HTS），斑马鱼可用于药物靶点验证和先导化合物筛选，例如在癫痫、心脏衰竭、炎症等模型中进行药物评价。
环境毒理学与生态毒理学：用于精确评估污染物（如纳米颗粒、农药）对生物体的毒性机制，研究涉及外源物代谢、氧化应激、DNA修复、免疫反应和内分泌干扰等通路。
挑战与未来方向
尽管技术不断进步，斑马鱼基因组编辑仍面临嵌合体、等位基因复杂性、可变种系传播效率以及遗传补偿（有害突变引发相关基因上调，掩盖表型）等挑战。精准编辑器（BE, PE）虽提高了核苷酸水平的精度，但其编辑效率常具有位点依赖性，且可能存在旁观者编辑。
未来发展方向包括：将编辑策略与实验目标（快速筛选 vs. 精确建模）更好匹配；采用自动化微注射、标准化工作流程和多组学验证管道以提高可重复性和可扩展性；对编辑结果进行更严谨的验证（如利用长读长测序检测结构变异）；以及明确区分F0代表型筛选（适用于快速功能筛查）和稳定品系生成（适用于可靠的基因型-表型关联和转化研究）的不同应用场景和解读标准。最终，斑马鱼的价值在于其作为连接遗传发现与治疗洞察的机制桥梁，而非临床预测的直接替代模型。
