《OncoTargets and Therapy》：Design and Engineering of Recombinant Oncolytic Adenoviruses Expressing an Anti-EpCAM/Anti-CD3 BiTE for Targeted Immunotherapy of A549 Lung Cancer Cells
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本文推荐一种表达抗EpCAM/抗CD3双特异性T细胞衔接器（BiTE）的重组溶瘤腺病毒（rOAd5-BiTE），该病毒能特异性感染A549肺癌细胞并分泌BiTE分子，在体外实验中显著激活T细胞、促进细胞因子（IFN-γ、IL-2）释放并增强肿瘤细胞毒性，为实体瘤的免疫病毒治疗提供了新策略。
背景
随着全球人口老龄化加剧，肺癌已成为全球癌症相关死亡的主要原因之一。据GLOBOCAN 2022年报告，肺癌在男性恶性肿瘤中发病率居首位，在女性中位列第三，全年新发病例约250万例。约70%的患者确诊时已处于晚期，五年生存率仅为15%。除传统的手术、放疗和化疗外，免疫治疗和靶向治疗近年来显著改变了肺癌的治疗格局。溶瘤病毒（oncolytic virotherapy, OVs）作为一种新兴治疗策略，能够选择性感染并在肿瘤细胞内复制，最终裂解肿瘤细胞，同时激发抗肿瘤免疫反应。
尽管溶瘤病毒在治疗实体瘤方面展现出潜力，但单药疗效有限。为提高治疗效果，本研究设计并构建了一种重组溶瘤腺病毒（rOAd5-BiTE），该病毒能够在肿瘤细胞内表达并分泌靶向上皮细胞粘附分子（EpCAM）和CD3的双特异性T细胞衔接器（bispecific T-cell engager, BiTE），从而将T细胞导向肿瘤微环境，实现精准免疫杀伤。
材料与方法
细胞培养与人外周血单核细胞（PBMC）分离
实验采用HEK293细胞进行病毒包装，A549人肺腺癌细胞系作为靶细胞。所有细胞均使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养。人PBMC来自健康志愿者外周血，经Ficoll密度梯度离心分离获得，实验经戈尔甘医科大学伦理委员会批准（批件号：IR.GOUMS.REC.1401.366）。
重组溶瘤腺病毒构建
采用AdEasy系统进行同源重组。将包含抗EpCAM/抗CD3_E1A?24基因的表达框插入pAdTrack穿梭载体，与pAdEasy-1腺病毒骨架载体在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组，获得重组腺病毒质粒recAd5D24-Anti-EpCAM-Anti-CD3-scFv（简称rOAd5-BiTE）。经PacI线性化后，转染HEK293T细胞进行病毒拯救。
病毒表达与功能验证
通过Western blot检测BiTE蛋白表达，使用鼠源抗His标签抗体识别55 kDa的目的条带。采用TCID50法和qPCR分别测定病毒生物学滴度和基因组拷贝数。MTT法检测细胞毒性，乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估肿瘤细胞杀伤效果。ELISA法检测细胞因子IFN-γ和IL-2分泌水平。
结果
病毒构建与表达验证
同源重组和限制性内切酶分析证实重组腺病毒构建成功。病毒转染HEK293T细胞后出现明显的细胞病变效应（CPE）和绿色荧光蛋白（GFP）表达。Western blot结果显示，在MOI=10条件下感染72小时，可检测到55 kDa的EpCAM BiTE特异性条带。
病毒复制与细胞毒性
TCID50测定显示病毒滴度为108TCID50/mL，qPCR分析进一步确认病毒拷贝数达2.316×108copies/mL。MTT实验表明，rOAd5-BiTE联合PBMC处理A549细胞后，细胞毒性呈时间和剂量依赖性增强，在MOI=100、作用72小时时杀伤效果最显著。
T细胞活化与细胞因子分泌
LDH释放实验显示，rOAd5-BiTE+PBMC组对A549细胞的杀伤率显著高于病毒或PBMC单独处理组（p<0.0001）。ELISA检测发现，共培养系统中IFN-γ和IL-2分泌水平明显升高，表明BiTE表达有效激活了T细胞免疫应答。
讨论
本研究成功构建了表达EpCAM/CD3 BiTE的重组溶瘤腺病毒，并在体外实验中验证其可有效感染肿瘤细胞、表达功能性BiTE分子，进而激活T细胞并增强对A549肺癌细胞的杀伤作用。与既往研究相比，本研究采用的EpCAM靶点具有更广泛的肿瘤表达谱，覆盖约90%的上皮源性肿瘤，具有重要的转化医学价值。尽管研究结果令人鼓舞，但仍需开展体内实验验证其在肿瘤微环境中的实际疗效，并进一步优化病毒载体设计以降低免疫原性。
结论
表达EpCAM/CD3 BiTE的重组溶瘤腺病毒在体外展现出显著的溶瘤活性和T细胞导向杀伤能力，为肺癌及其他EpCAM阳性实体瘤的免疫病毒治疗提供了新思路。该平台有望与现有免疫治疗方法联合应用，或通过靶向递送系统优化，推动临床转化进程。
