《OncoTargets and Therapy》：NG25 Enhances Anti-Tumor Immunity in KRAS-Mutant Colorectal Cancer
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本文系统阐述TAK1抑制剂NG25在KRAS突变结直肠癌中的免疫调节机制，揭示其通过抑制TAK1/NF-κB轴下调PD-L1/PD-1表达，促进CD8+T细胞浸润与分化，为KRAS驱动肿瘤的免疫治疗提供新策略。
NG25增强KRAS突变结直肠癌抗肿瘤免疫的机制研究
Abstract
研究目的：KRAS突变结直肠癌预后差归因于其免疫抑制肿瘤微环境和缺乏有效靶向治疗。转化生长因子-β激活激酶1（TAK1）作为NF-κB和MAPK信号通路的关键上游调节因子，通过异常激活促进肿瘤进展。本研究旨在探讨TAK1抑制剂NG25在KRAS突变结直肠癌中的抗肿瘤和免疫调节作用，重点关注其对T细胞分化、PD-L1表达和肿瘤免疫微环境重塑的影响。
研究方法：通过体外肿瘤细胞-淋巴细胞共培养系统、免疫缺陷Balb/c裸鼠和免疫健全Balb/c小鼠原位结直肠癌模型评估NG25的抗肿瘤和免疫增强作用。
研究结果：NG25在免疫健全Balb/c小鼠中显著抑制肿瘤进展，同时增加脾脏和胸腺指数，促进T、B淋巴细胞增殖。在肿瘤微环境中，NG25处理可促进CD8+T细胞浸润并增加CD3+CD8+T细胞亚群比例。机制研究表明，NG25通过抑制TAK1/NF-κB轴下调KRAS突变肿瘤细胞和T细胞上的PD-L1表达，但这种调节作用在KRAS野生型肿瘤细胞中缺失。
研究结论：NG25通过靶向TAK1阻断NF-κB信号通路，重塑KRAS突变结直肠癌的免疫抑制微环境，降低PD-1表达并增强CD8+T细胞的抗肿瘤作用。本研究为TAK1靶向治疗提供理论基础，并为KRAS突变结直肠癌的免疫治疗提供新策略。
Introduction
结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤，约40%病例存在KRAS突变。这些突变与预后不良以及对常规化疗和表皮生长因子受体靶向治疗的耐药性相关。尽管免疫检查点抑制剂在微卫星高度不稳定结直肠癌和非小细胞肺癌中显示出良好疗效，但其在KRAS突变肿瘤中的临床获益仍然有限。这种免疫耐药主要由两种机制驱动：KRAS介导IL-8和CCL2等细胞因子分泌，从而招募髓源性抑制细胞和调节性T细胞；同时，KRAS通过ERK和三叶草因子途径诱导PD-L1表达上调，导致T细胞活化受损和免疫抑制肿瘤微环境形成。因此，确定KRAS突变结直肠癌的有效治疗策略仍是紧迫挑战。
TAK1是整合炎症和应激信号到下游NF-κB和MAPK级联的关键上游介质。在TNF-α、IL-1β或TGF-β等细胞因子刺激下，TAK1与TAK1结合蛋白结合并招募TRAF2或TRAF6，催化TAK1 Lys158位点的Lys63连接多聚泛素化以促进其活化。激活的TAK1磷酸化IKK复合物，导致IκBα降解和NF-κB核转位，从而诱导炎症、细胞存活和免疫调节相关基因的转录。TAK1-NF-κB轴的异常激活有助于结直肠癌等多种恶性肿瘤的慢性炎症、肿瘤进展和免疫逃逸。这些机制为靶向TAK1抑制肿瘤生长和重塑免疫抑制肿瘤微环境提供了有力理论依据。
NG25是一种选择性、ATP竞争性TAK1抑制剂，可有效抑制其激酶活性。它在炎症性疾病和各种癌症中显示出治疗潜力。在乳腺癌中，NG25通过抑制TAK1增强多柔比星诱导的凋亡；在结直肠癌中，它在细胞培养和小鼠模型中抑制肿瘤增殖并诱导caspase依赖性凋亡。然而，NG25在调节肿瘤免疫中的作用，特别是在KRAS突变结直肠癌微环境中的作用仍不清楚。
本研究旨在阐明NG25如何调节TAK1-NF-κB-PD-L1信号轴并重塑KRAS突变结直肠癌的免疫抑制肿瘤微环境，从而增进我们对TAK1靶向免疫调节的理解，并为KRAS驱动恶性肿瘤提供潜在治疗方法。
Materials and Methods
化学品与试剂：NG25和5-FU购自Sigma-Aldrich。红细胞裂解液购自碧云天。MidiMACS起始试剂盒、LS色谱柱和Pan T细胞分离试剂盒II购自美天旎。使用以下抗体：IκBα和p-IκBα购自CST；TAK1和p-TAK1购自Santa Cruz Biotechnology；PD-L1购自Thermo Fisher Scientific；β-actin购自Sigma-Aldrich；CD3、PD-L1和CD4购自eBioscience；CD8α购自BD Biosciences；PD-1购自BD Pharmingen?和CD8α购自Abcam。
细胞系与细胞培养：HCT116KRASG13D和HCT116KRASWT结直肠癌细胞系由哈佛医学院惠赠。小鼠结直肠癌细胞系CT26购自昆明细胞库。所有细胞系在含5%胎牛血清的DMEM高糖培养基中维持培养，培养条件为37°C、5% CO2的湿润环境。
原位小鼠模型与处理：8只雄性Balb/c裸鼠和8只雄性Balb/c小鼠在SPF条件下适应7天。用异氟烷麻醉小鼠，将CT26KRASG12D细胞注射到盲肠肠系膜三角区。植入一周后，按免疫状态随机分组：裸鼠-对照组或NG25组；Balb/c小鼠-对照组或NG25组，均腹腔注射给药。治疗7天后记录体重，收集肿瘤并测量体积和重量。
T淋巴细胞磁珠分离：轻轻研磨Balb/c小鼠脾脏获得单细胞悬液，离心去除上清。加入红细胞裂解液裂解红细胞，离心后弃上清。使用Pan T细胞分离试剂盒II按照说明书分离T淋巴细胞。
淋巴细胞共培养与T细胞表面抗原流式分析：将磁性分选的T淋巴细胞与CT26细胞共培养24小时。加入NG25处理48小时后收集细胞，用抗T淋巴细胞表面标志物抗体染色，流式细胞术分析T淋巴细胞分化和PD-L1表达。
淋巴细胞扩增试验检测免疫功能：将脾淋巴细胞以5×106细胞/mL密度接种于96孔板。用植物血凝素、脂多糖或两者联合刺激细胞培养72小时。加入MTT试剂继续培养4小时，用DMSO溶解甲臜沉淀，测量540 nm吸光度计算刺激指数。
Western Blot分析蛋白表达水平：用不同浓度NG25处理HCT116KRASG13D和HCT116KRASWT细胞系48小时。收集细胞用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，Bradford法测定浓度。等量蛋白通过SDS-PAGE分离并转印至PVDF膜，封闭后与一抗4°C孵育过夜。洗涤后加入HRP标记二抗室温孵育1小时，ECL底物显影，ImageJ软件分析条带强度。
RT-PCR分析基因表达：用NG25处理HCT116KRASG13D和HCT116KRASWT细胞48小时。收集细胞用TRIzol试剂提取总RNA，按照说明书合成cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master在7500实时PCR系统上进行qPCR分析，2?ΔΔCt法计算相对基因表达水平。
免疫组化染色：石蜡包埋的小鼠结肠癌组织用5%山羊血清封闭，4°C与抗CD3和CD8一抗孵育过夜。次日复温后加入二抗37°C孵育1小时，DAB底物显色，苏木精复染。每样本随机选择5个高倍视野成像，ImageJ软件基于染色强度和阳性细胞百分比进行评分。
统计分析：使用SPSS v24.0进行统计分析，GraphPad Prism制图。数据以均值±标准差表示。正态分布数据采用Student t检验进行两组比较，单因素方差分析进行多组比较；非正态分布数据采用非参数检验。p值<0.05认为有统计学意义。
Results
NG25的抗肿瘤疗效与宿主免疫能力相关
为评估宿主免疫功能是否影响NG25的抗肿瘤疗效，我们建立了免疫缺陷Balb/c裸鼠和免疫健全Balb/c小鼠的原位结直肠癌模型。CT26KRASG12D细胞腹腔注射和治疗7天后，NG25在免疫缺陷Balb/c裸鼠模型中表现出一定程度的肿瘤抑制作用。然而两组间治疗效果存在显著差异。在免疫健全组中，NG25治疗使肿瘤体积比生理盐水对照组减少约80%，而在裸鼠中抑制率约为20%。这些结果表明NG25的抗肿瘤作用至少部分依赖于功能性免疫系统的存在。
NG25增强小鼠多层次免疫功能
为进一步研究NG25对宿主免疫能力的影响，我们评估了原位结直肠癌小鼠模型的胸腺指数和脾脏指数，这些是系统性免疫状态的指标。与生理盐水对照组相比，NG25治疗显著增加脾脏指数和胸腺指数，表明免疫器官功能增强。NG25还促进免疫活性：淋巴细胞增殖试验证明NG25处理增强T细胞和B细胞的体外增殖能力。相比之下，常规化疗药物5-氟尿嘧啶处理抑制淋巴细胞增殖，与临床观察到的5-FU诱导免疫抑制一致。
NG25促进抗肿瘤肿瘤微环境形成
免疫组化分析显示，NG25处理显著增加原位结直肠肿瘤中CD3+CD8+T细胞浸润，表明NG25增强细胞毒性T淋巴细胞招募。为进一步研究NG25对T细胞功能的影响，我们建立CT26肿瘤细胞与CD3+淋巴细胞体外共培养模型。NG25暴露48小时后，流式细胞术分析T细胞表面标志物表达。结果显示T细胞分化发生显著改变。CD3+CD8+T细胞比例从6%增加至14%，而CD3+CD4+T细胞比例从42.1%下降至22.3%。这些发现表明NG25通过双重机制促进抗肿瘤免疫—增强细胞毒性T淋巴细胞招募和增加肿瘤微环境中细胞毒性T淋巴细胞比例。
NG25通过KRAS突变依赖性机制调节PD-L1表达
PD-L1通过结合T细胞表面PD-1受体在肿瘤微环境中发挥关键免疫抑制作用，从而抑制抗肿瘤免疫反应。为检验NG25是否调节PD-L1表达，用NG25处理结直肠癌细胞并评估mRNA和蛋白水平。用NG25处理HCT116KRASG13D细胞48小时导致PD-L1蛋白显著下调，特别是在5μM浓度下。相比之下，HCT116KRASWT细胞中PD-L1蛋白水平未显示可比下降。一致地，PD-L1 mRNA分析显示仅在5μM NG25处理下HCT116KRASG13D细胞中出现显著转录下调，而相同条件下HCT116KRASWT细胞不受影响。这些结果表明NG25介导的PD-L1抑制特异性依赖于KRAS突变状态。
重要的是，NG25也影响免疫细胞。在CT26细胞与Balb/c小鼠脾脏分离的CD3+T细胞共培养中，NG25处理48小时使PD-1阳性CD3+T细胞比例从13.33%降低至3.8%。这些发现共同表明NG25可能通过KRAS突变依赖性机制下调T细胞中PD-1表达和肿瘤细胞中PD-L1表达来重塑免疫抑制肿瘤微环境。
NG25通过TAK1/NF-κB信号轴抑制PD-L1和PD-1表达
为阐明NG25下调PD-L1的机制，我们聚焦于TAK1的经典下游效应通路NF-κB。NF-κB激活广泛参与促进PD-L1表达和建立免疫抑制肿瘤微环境。在该通路中，IκBα作为关键抑制蛋白，通过将NF-κB锚定在细胞质中发挥调节作用。当IκBα被IKK磷酸化和降解时，NF-κB可进入细胞核启动转录过程。
基于NG25可通过靶向TAK1抑制KRAS突变结直肠癌中NF-κB通路的报道，我们推测NG25可能通过该通路调节PD-L1。结果显示NF-κB抑制剂PDTC处理HCT116KRASG13D细胞降低PD-L1表达；类似地，NG25处理显著降低KRAS突变结直肠癌细胞中PD-L1表达。此外，在NG25处理的原位结直肠癌荷瘤小鼠肿瘤组织中，PD-L1表达被抑制，同时伴随IκBα磷酸化降低（NF-κB激活的关键标志）。这些发现证明NG25通过TAK1/NF-κB信号轴下调PD-L1表达，从而减少T细胞抑制并促进抗肿瘤免疫反应。
Discussion
结直肠癌的进展涉及致癌突变与肿瘤免疫微环境之间的复杂相互作用。其中，KRAS突变结直肠癌由于靶向治疗有限和免疫耐药表现出特别差的结局。TAK1作为连接NF-κB和MAPK信号的中心枢纽，调节肿瘤细胞存活、炎症和免疫调节。TAK1异常激活与包括结直肠癌在内的多种恶性肿瘤相关，并与不良预后相关，使TAK1成为有前景的治疗靶点。
本研究证明TAK1抑制剂NG25在KRAS突变结直肠癌中抑制肿瘤生长并增强抗肿瘤免疫，且这种治疗效果与机体免疫力相关。NG25处理通过抑制TAK1/NF-κB信号轴下调肿瘤细胞PD-L1表达和T细胞PD-1表达，促进CD8+T细胞浸润，重塑肿瘤微环境。这些发现揭示NG25发挥双重抗肿瘤和免疫调节作用，为免疫难治性结直肠癌中TAK1靶向治疗提供理论依据。
我们的结果表明增强的CD8+T细胞浸润和增殖反映更免疫激活的肿瘤微环境。先前研究支持通过TAK1阻断或Sirt1激活抑制NF-κB可减少促炎细胞因子如IL-1β和IL-6，表明NG25也可能重塑细胞因子网络以恢复免疫平衡。此外，NG25下调PD-L1与NF-κB在PD-L1转录控制中的作用一致，进一步支持TAK1抑制与免疫再激活之间的机制联系。
尽管有这些 promising 观察结果，仍需承认几个局限性。当前研究未直接评估CD8+T细胞的细胞毒性功能；需要细胞内IFN-γ或颗粒酶B染色等功能试验进行确认。脾脏和胸腺指数的解释也需谨慎，因为临床环境中脾肿大与不良预后相关。此外，NG25是否调节抗原呈递（如MHC-I表达）仍有待确定。最后，NG25的长期疗效和安全性需要在扩展的临床前和转化研究中进一步验证。
展望未来，我们旨在阐明NG25重塑结直肠癌免疫微环境的详细机制—特别是其对免疫相关转录网络、细胞因子信号和肿瘤抗原呈递的调节。整合转录组学和生物信息学分析，结合全面药理学评价，将深化对NG25免疫调节潜力的理解，并指导KRAS突变结直肠癌治疗的合理联合策略。
Conclusion
总之，在抗肿瘤疗效和免疫微环境重塑方面，我们证明NG25处理显著抑制KRAS突变结直肠癌细胞增殖和肿瘤生长，并通过调节肿瘤细胞PD-L1表达和T细胞PD-1表达，增强CD8+T细胞分化和浸润来重塑免疫抑制肿瘤微环境。我们提出NG25的抗肿瘤活性通过TAK1-NF-κB潜在免疫调节轴介导。这些发现为开发基于TAK1抑制剂的免疫疗法提供理论基础，并为KRAS突变结直肠癌提供有前景的新治疗策略。
Abbreviations
CRC，结直肠癌；TAK1，转化生长因子-β激活激酶1；MDSCs，髓源性抑制细胞；NSCLC，非小细胞肺癌；ICIs，免疫检查点抑制剂；Tregs，调节性T细胞；TTP，三叶草因子；TME，肿瘤微环境；IL-1β，白细胞介素-1β；PDAC，胰腺导管腺癌；GBM，胶质母细胞瘤；IHC，免疫组织化学；WT，野生型；LPS，脂多糖；PHA，植物血凝素；OD，吸光度；SI，刺激指数。
