铜绿假单胞菌σ28依赖性转录起始的结构解析及其抗σ因子调控新机制

《Nucleic Acids Research》：Structural insights into σ28-dependent transcription initiation and its regulation by anti-sigma factor in Pseudomonas aeruginosa

本研究为解决铜绿假单胞菌晚期鞭毛基因转录调控机制不清的问题，通过解析σ28-FlgM复合物晶体结构（1.95?）和σ28-RNAP开放启动子复合物冷冻电镜结构（3.4?），首次揭示了σ28被FlgM抑制时呈现不利于结合RNAP和DNA的紧凑构象，并发现σ28启动子识别中独特的-35元件碱基特异性相互作用、-11模板链碱基翻转以及σ指部分插入活性位点等新特征。该研究为理解Group 3 σ因子转录起始机制提供了关键结构基础，对病原菌鞭毛装配及毒力调控研究具有重要意义。

　　

在细菌的生存策略中，鞭毛就像精密的分子马达，驱动着细菌向营养物质迁移或逃离危险环境。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为条件致病菌，其单极鞭毛的装配涉及约50个基因的级联表达，其中晚期鞭毛基因（如鞭毛蛋白编码基因fliC）的转录由Group 3 σ因子σ²⁸（FliA）主导。然而，这一过程受到抗σ因子FlgM的严格调控：在鞭毛钩-基底体复合物组装完成前，FlgM会像"分子锁"一样束缚σ²⁸，阻止其与RNA聚合酶（RNAP）结合；待分泌系统成熟后，FlgM被排出胞外，σ²⁸才得以启动鞭毛蛋白合成。尽管该调控通路已被发现数十年，σ²⁸与FlgM的相互作用机制及其在转录起始过程中的动态构象变化始终是结构生物学领域的谜题。

为解决这一难题，印度区域生物技术中心的Deepti Jain团队在《Nucleic Acids Research》发表了突破性研究。他们首次同步解析了铜绿假单胞菌来源的σ²⁸-FlgM复合物晶体结构（1.95?）和σ²⁸-RNAP开放启动子复合物冷冻电镜结构（3.4?），如同拍摄到了"分子锁"的钥匙形态及其解锁后的工作状态。研究发现，FlgM通过包覆σ²⁸的三个结构域（σ₂, σ₃, σ₄）使其形成紧凑构象，其中σ₃-σ₄连接区（3/4 linker）像弹簧一样被压缩在FlgM形成的沟槽中。这种构象下，σ²⁸既无法结合RNAP，也不能识别启动子DNA。而转录起始复合物结构则展现出Group 3 σ因子特有的三重特征：σ₄结构域与-35元件（TCTAAAG）存在碱基特异性相互作用（如Q228与-36T形成氢键）；模板链-11T碱基发生翻转并与σ₂/σ₃形成新型稳定作用；σ指（sigma finger）仅部分插入活性位点裂隙，提示该结构可能捕获了开放复合物形成的中间状态。

研究团队通过蛋白质复合物结晶与冷冻电镜单颗粒分析技术，结合等温滴定量热法（ITC）验证相互作用界面，利用荧光转录实验和体内鞭毛表型分析（游泳运动实验、透射电镜观察）系统验证了结构发现。其中冷冻电镜数据处理采用3D变异性分析技术提升了-35区域DNA密度质量，而体内实验则通过构建σ²⁸敲除株并回补突变体基因进行功能验证。

σ²⁸-FlgM复合物结构

通过截短σ²⁸的N端10个氨基酸和FlgM的N端60个氨基酸，获得高分辨率晶体结构。FlgM的两段螺旋像钳子一样夹住σ²⁸，其C端螺旋的疏水斑块（V96-A97-L100-L101）与σ₄的L187/L204等残基形成关键疏水作用，而带电残基（如FlgM的E104/R107）与σ²⁸的R40/Y206等形成氢键网络。ITC实验证实，破坏界面残基（如L187R/L204R突变）会使结合亲和力降低200倍，说明该界面是σ²⁸活性的核心调控开关。

开放启动子复合物结构特征

与E.coli σ⁷⁰系统相比，σ²⁸启动子识别存在显著差异：-7位碱基不发生翻转（因缺乏σ_1.2区域），而翻转的-11A（非模板链）和-11T（模板链）分别由σ₂的Y76和σ₃的H100稳定。尤其值得注意的是，σ指部分插入的状态使模板链在-8至-5区呈现高流动性，这可能延缓启动子完全开放进程。启动子DNA弯曲程度较σ⁷⁰系统更小，可能与富含GC的间隔区序列有关。

功能验证揭示关键残基作用

通过点突变验证了结构预测的功能残基：σ₄的Q228A突变使体外转录活性下降至野生型的15%，细菌运动性恢复仅36%，且鞭毛装配率降低50%；σ₂的R80A（对应σ⁷⁰的W434）突变导致运动性缺陷达70%，说明其虽无色氨酸"楔子"功能，却通过稳定-12G参与DNA熔解。双突变体L86A_H100A表现出协同效应，证实σ₂/σ₃对模板链的共同稳定作用。

这项研究首次在同一病原菌系统中揭示了σ因子从抑制状态到转录起始状态的完整构象变化轨迹。其意义不仅在于刷新了对Group 3 σ因子工作机制的认知——例如发现σ²⁸通过增强模板链相互作用补偿经典σ⁷⁰系统的功能缺失，更为理解病原菌环境适应性提供了新视角。在囊性纤维化患者气道中，铜绿假单胞菌会抑制鞭毛表达以逃避免疫识别，该研究揭示的分子开关机制为开发针对细菌运动性和毒力的新型抑制剂提供了精准靶点。如同破解了细菌"运动指挥部"的密码本，这项工作标志着微生物转录调控研究进入了原子分辨率的新阶段。