《Analytical Chemistry》：Rapid Analysis of Pacific Ciguatoxins in Fish Extracts with a Lateral Flow Assay
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本综述系统介绍了首个用于检测太平洋雪卡毒素（CTXs）的侧向层析检测法（LFA）。该技术基于高亲和力单克隆抗体（如3G8、10C9、8H4），采用夹心法原理，可在30分钟内实现视觉判读，视觉检测限达400 pg/mL，对鱼类提取物中CTXs的检测 cutoff 值约为0.1 μg/kg。该方法具有高特异性、操作简便等优势，为资源有限地区防控雪卡毒素中毒（CP）提供了强有力的快速筛查工具。
雪卡毒素与公共卫生挑战
海洋毒素是一类主要由特定藻类、蓝细菌、硅藻和甲藻产生的天然化合物。雪卡毒素（Ciguatoxins, CTXs）是其中一类强效的神经毒素，是导致雪卡毒素中毒（Ciguatera Poisoning, CP）的元凶。CP是全球最常见的海产品中毒性疾病，每年估计可影响高达5万人。雪卡毒素或其前体由底栖甲藻属（Gambierdiscus）产生，具有热稳定性，无法通过烹饪或冷冻消除，且目前尚无已知解毒剂。传统上，CP主要流行于热带和亚热带地区，但由于水温升高、珊瑚礁破坏以及海产品贸易全球化等因素，其分布范围已扩展至非传统流行区域，甚至在欧洲也被视为一种新兴风险。
雪卡毒素是脂溶性聚醚类化合物，存在超过30种同系物，可根据化学结构进行分类。太平洋雪卡毒素（如CTX1B和CTX3C）通常被认为是毒性最强的一类，对小鼠的半致死剂量（LD50）为0.25–0.9 μg/kg体重。美国食品药品监督管理局（FDA）已设定指导限值，太平洋CTX1B当量为0.01 μg/kg，而加勒比海CTX-1（C-CTX1）为0.1 μg/kg。欧洲虽未明确设定法规限值，但禁止销售含有可检出水平CTXs的鱼类。因此，避免食用受污染海产品是降低CP风险的最有效策略，而这依赖于对毒素的早期、可靠检测。
雪卡毒素检测技术发展历程
现有的CTXs检测方法大致可分为生物学方法、化学方法和生化方法。生物学方法包括小鼠生物测定法、细胞毒性试验和受体结合试验。虽然这些方法具有一定优势，但其灵敏度、特异性、成本以及伦理方面的局限性推动了替代检测方法的发展。化学方法，特别是液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），是检测CTXs并提供毒素谱的领先技术，具有极高的灵敏度和特异性。生化检测法则依赖于特异性抗体，应用于酶联免疫吸附试验（ELISA）和各种生物传感器平台。
针对CTXs的特异性抗体开发始于20世纪70年代末，但直到21世纪初才报道了针对太平洋雪卡毒素的高亲和力、高特异性抗体。研究人员通过合理设计模拟CTXs分子部分结构的合成半抗原，成功开发了针对CTX1B左翼的小鼠单克隆抗体3G8 IgG、针对CTX3C左翼的10C9 IgG，以及针对CTX1B右翼（也能结合CTX3C右翼）的8H4 IgG。通过将3G8、10C9和8H4三种抗体组合在单一夹心ELISA中，实现了对四种主要太平洋CTXs同系物（CTX1B、54-脱氧CTX1B、CTX3C和51-OH-CTX3C）的检测，检测限（LOD）低于1 pg/mL，并成功在鱼肉中检出达到FDA指导水平（0.01 μg/kg）的CTX1B。这些抗体后来被进一步用于开发基于磁珠的比色检测法和电化学生物传感器，其LOD也达到了低pg/mL水平。
侧向层析检测技术及其在海洋毒素检测中的应用
侧向层析检测法（Lateral Flow Assay, LFA）近年来在海洋毒素检测领域引起了广泛关注。这种简单、快速、低成本的测试方法适用于资源有限的环境，可在30分钟内提供视觉结果，有助于及时决策并确保食品安全。迄今为止，文献中报道的大多数LFA采用竞争法格式和信号减弱（signal-off）的比色视觉检测，主要靶向河豚毒素（TTX）、冈田酸（OA）、多米酸（DA）、石房蛤毒素（STXs）、鳍藻毒素（DTXs）、短裸甲藻毒素B（PbTx-2）和环亚胺毒素（CIs），用于单重或多重同时检测多种毒素。
首个太平洋雪卡毒素LFA的开发与设计
本研究报道了首个用于检测CTX1B和CTX3C主要同系物的LFA测试方法，该测试基于信号增强（signal-on）的夹心法，采用了Tsumuraya及其同事先前开发的抗体。LFA测试的设计如下：针对CTX1B左翼的3G8 IgG和针对CTX3C左翼的10C9 IgG以相等浓度固定在测试线（T线）上；而针对CTX1B和CTX3C共同右翼的8H4 IgG与40纳米金纳米颗粒（AuNPs）偶联（形成8H4@AuNPs复合物），并沉积在结合垫上。当样品加到样品垫上后，通过毛细作用沿试纸条流动。如果样品中存在任何主要的CTXs同系物（CTX1B、54-脱氧CTX1B、CTX3C或51-OH-CTX3C），它将被固定在AuNPs上的8H4抗体结合，然后该复合物会被测试线上的两种抗体之一（取决于样品中存在的特定CTX）捕获，最终形成一条红线。剩余的8H4@AuNPs复合物将在控制线（C线）被抗小鼠抗体捕获，形成另一条红线，表明测试功能正常。
LFA关键参数的优化
研究人员首先优化了8H4@AuNPs复合物的制备条件，包括确定提供胶体稳定性所需的抗体浓度。随后，对多个测试参数进行了系统优化，以实现CTXs的灵敏检测。
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纳米颗粒标记物的选择：评估了球形金纳米颗粒（AuNPs；40 nm）、金海胆状纳米颗粒（AuNUs；90 nm）、链霉亲和素修饰的金纳米颗粒（SA@AuNPs；40 nm）和碳纳米颗粒（CNPs；25 nm）等不同标记物。结果表明，40 nm球形AuNPs能提供最高的信号和信噪比，因此被选为后续开发的标记物。
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硝酸纤维素（NC）膜类型：比较了两种常用NC膜（FF120HP和FF170HP）。FF170HP膜具有更小的孔径和较慢的流速，在更短的检测时间（25-30分钟）内能产生更高的测试线强度，因此被选用。
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抗体浓度与检测时间：优化了测试线抗体（3G8和10C9）的浓度。使用1.5 mg/mL的每种抗体比1 mg/mL能产生更高的测试线信号。检测时间超过20分钟后信号仅有轻微增加，而银增强步骤未显示出显著效果。因此，最终确定使用1.5 mg/mL的抗体浓度和30分钟的检测时间，且无需银增强。
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膜封闭与缓冲液添加剂：为了简化试纸条制备，通常优选未封闭的NC膜，并将所需的任何封闭剂加入样品垫。然而，在CTXs LFA测试中，使用未封闭膜与预处理样品垫组合时，偶尔会出现非特异性信号。通过评估多种运行缓冲液添加剂（如BSA和脱脂奶粉），并使用封闭过的NC膜，有效消除了这些非特异性信号。为了在分析复杂样品（如鱼类提取物）时防止非特异性信号，最终确定使用封闭过的膜和添加了BSA（1% w/v）的运行缓冲液。
LFA的灵敏度与特异性评估
在优化条件下，通过分别构建CTX1B和51-OH-CTX3C的校准曲线，评估了LFA的分析灵敏度。结果显示，随着CTXs浓度的增加，测试线强度逐渐增强，这与信号增强型测试的特点一致。该测试对CTX1B和51-OH-CTX3C的视觉检测限（vLOD）均为400 pg/mL。使用便携式LFA读数器测量时，根据S型曲线计算出的LOD分别为CTX1B 306 pg/mL和51-OH-CTX3C 426 pg/mL。该测试还表现出高度的特异性，对其他测试的海洋毒素（石房蛤毒素STX、多米酸DA、冈田酸OA、河豚毒素TTX和短裸甲藻毒素B PbTx-2）均未产生信号，并且这些毒素的存在不干扰CTXs的检测。
在鱼类样品分析中的应用性能
通过使用未污染和受污染的鱼类提取物，评估了太平洋CTXs LFA测试分析鱼类样品的适用性。
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加标回收实验：最初使用未封闭NC膜测试时，虽然在所有加标提取物中均成功检出CTX1B，但观察到显著高估（回收率161%–178%），并且在未加标的空白提取物中也检测到非特异性信号。使用封闭膜制备的LFA试纸条有效消除了这些背景信号。当使用未稀释的鱼类提取物（相当于250 mg鱼肉）时，对加标至1000 pg/mL的CTX1B和51-OH-CTX3C均实现了有效检测，且准确度提高，回收率分别为115.3%和113.7%。
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天然污染样品检测：最后，将LFA测试应用于经LC-MS/MS确认的天然受污染鱼类提取物。在分析的十个样品中，九个为LC-MS/MS确认阳性，一个为阴性。LFA测试在九个阳性样品中的七个中检出了CTXs。出现假阴性的两个样品中，一个（FE24003）的CTXs浓度（66 pg/mL）低于LFA的LOD，另一个（FE24002）通过视觉判读为阴性（但LC-MS/MS报告浓度为543 pg/mL），其原因可能与该样品中CTX1B含量最低且52-表-54-脱氧CTX1B可能被 assay 识别较差有关。值得注意的是，使用LFA读数器测量测试线强度时，该样品被正确识别为CTX阳性。LFA测试也正确识别了阴性样品。
需要指出的是，本研究中使用的是经过多步提取和纯化程序制备的高度纯化的鱼类提取物，这以及使用封闭NC膜，共同促成了LFA在加标和天然污染样品中良好的应用性能，因为更洁净的提取物减少了基质成分的潜在干扰。然而，基质效应无法完全预测，因为鱼类组织的成分因物种、个体、大小和来源而异，这可能影响检测性能。未来研究应侧重于开发快速、可靠、高效的提取方法，以确保CTXs的高回收率并保持最低的基质干扰。
结论与展望
本研究成功开发了一种简单、快速的LFA测试方法，用于检测太平洋雪卡毒素的主要同系物。该测试可在30分钟内通过一步操作实现对鱼类样品的视觉筛查，其检测限约为0.1 μg/kg（通过分析未稀释的样品FE20101和FE20110证明）。这一检测限足以检测CP患者食物残留物中的CTXs（据报道最低含量为0.025 MU/g，相当于0.175 μg/kg CTX1B）。也有研究指出，CTX1B在低至0.1 μg/kg的浓度下即可诱发雪卡中毒症状，并建议0.1–0.2 μg/kg的阈值可能比美国FDA的谨慎指导水平0.01 μg/kg更适用于CP风险管理。由于高纯度CTX标准品的获取有限且成本高昂，制约了更灵敏检测方法的开发，因此本LFA测试作为一种快速筛查工具，在疫情调查和研究项目中展现出巨大潜力。优化样品处理和毒素提取流程对于将该LFA充分评估并推广至现场应用至关重要。
