天然ADP-核糖基化寡核苷酸的化学合成及其在DNA ADP-核糖基化水解酶特异性分析中的应用

《Journal of the American Chemical Society》：Chemical Synthesis of Native ADP-Ribosylated Oligonucleotides Enables Analysis of DNA ADP-Ribosylation Hydrolase Specificity

本综述系统阐述了ADP-核糖基化（ADPr）从传统蛋白质修饰到新型核酸修饰的范式转变。作者团队开创性地建立了化学合成方法，成功制备了结构明确的胸苷-ADPr（T-ADPr）及其寡核苷酸衍生物（如TCT-ADPr-C），解决了该领域长期缺乏分子工具的瓶颈。利用合成探针，研究揭示了细菌DarG和人类TARG1等水解酶对α构型ADPr的特异性识别机制，证实了寡核苷酸底物相较于单核苷酸的催化优势，为研究核酸ADPr在细菌防御、神经退行性疾病等过程中的功能提供了关键技术支撑。

　　

化学与立体选择性合成T-α-核糖构建模块5

构建胸苷-ADPr（T-ADPr）的关键分子是N³-α-核糖基化胸苷（如化合物5），其中含有罕见的α-亚胺糖苷键。本研究设计了三种高反应活性的核糖供体：对甲苯硫醇核糖供体（3a）、N-苯基-2,2,2-三氟乙亚胺酸酯供体（3b）和邻炔基苯甲酸酯供体（3c）。通过条件筛选发现，使用3b供体与胸苷受体4在TMSOTf活化下于室温反应12小时，能以70%的收率获得目标产物5。二维核磁共振（HMBC和NOESY）分析证实了N³连接和α构型。值得注意的是，反应过程中会先形成O-糖苷异构体5A，升高温度可促使其转化为热力学更稳定的N-糖苷5。

T-ADPr两种异构体（1a和1b）的化学合成

获得关键中间体5后，通过TIPS脱保护、磷酸三酯引入、吡啶酸脱Fm保护获得磷酸单酯，继而采用"P(III)–P(V)"方法进行焦磷酸组装：先与腺苷亚磷酰胺9偶联，氧化后脱除CE保护基，再经氨水处理脱除酰基保护得到化合物11，最后通过Pd/C催化氢解脱苄基，以29%的总收率得到α构型的T-ADPr（1a）。对于β构型T-ADPr（1b）的合成，采用Mitsunobu反应将半缩醛13与胸苷4缩合，以67%的收率和高立体选择性获得β构型核糖胸苷14，后续类似反应步骤最终以33%的总收率得到1b。构型差异导致1a的氢解脱苄收率低于1b，可能与α构型中苄基的空间位阻效应有关。

合成T-α-ADPr（1a）和T-β-ADPr（1b）对ADPr水解酶的敏感性

利用化学合成的T-ADPr底物结合AMP-Glo检测技术，研究人员系统评估了多种ADPr水解酶对T-ADPr的水解活性。结果显示，来自水生栖热菌（T. aquaticus）的DarG和与人类神经退行性疾病相关的TARG1能高效水解T-α-ADPr，而对T-β-ADPr无活性，表明水解酶对生理相关的α构型具有严格特异性。人类水解酶ARH3和MACROD2对T-α-ADPr仅显示微弱活性，且其催化突变体活性完全丧失。在果蝇（D. melanogaster）水解酶中，TARG1同源蛋白Targ1和Targ3也表现出对T-α-ADPr的特异性水解能力，为研究人类TARG1功能提供了潜在模型。

ADP-核糖基化寡核苷酸的自动固相合成

为实现更生理相关的ADPr-DNA探针合成，研究团队开发了关键二糖亚磷酰胺构建模块23的合成路线：胸苷15经3,5-O-乙酰丙酰化（Lev）保护后，与供体3b进行TMSOTf促进的糖基化反应，以88%的收率和8.5:1的α/β选择性获得核糖胸苷17。经过脱苄基、乙酰化、TIPS脱保护、Fm保护磷酸三酯引入以及Lev选择性脱保护等多步操作后，最终在5′-和3′-OH分别引入Dmt和亚磷酰胺基团，得到关键中间体23。ADP-核糖基化寡核苷酸2A（TCT-ADPr-C）通过固相合成实现：首先在dC-Bz-CPG树脂24上通过标准亚磷酰胺化学（Cycle A）耦合关键砌块23；随后通过Cycle B依次连接dC和dT亚磷酰胺单元延长DNA链；最后通过Cycle C完成ADPr部分的组装：先脱除Fm和CE保护基形成磷酸单酯，再与腺苷亚磷酰胺9偶联构建焦磷酸键，经氧化和脱保护后，通过氨水裂解和纯化得到目标产物2A，总收率达13%。同时合成了TTT-ADPr-C（2B）和TT-ADPr-T（2C）用于序列特异性研究。

ADPr水解酶对ADP-核糖基化寡核苷酸的更高活性

合成获得的ADP-核糖基化ssDNA寡核苷酸为直接评估水解酶活性提供了理想工具。AMP-Glo检测表明，DarG、人类TARG1和果蝇Targ蛋白对TT-ADPr-T均表现出强水解活性。酶滴定实验进一步揭示，与T-α-ADPr相比，DarG对含天然序列TCTC的TCT-ADPr-C具有更高水解效率，且对末端为胞苷（C）的底物偏好优于胸苷（T），这与DarTG系统的共识序列特征一致。类似地，链霉菌SCO6735和人类TARG1也对寡核苷酸底物表现出增强的水解活性，表明这种底物偏好性在细菌和人类酶中具有保守性。

结论

本研究建立了化学合成明确结构核酸-ADPr探针的有效方法，包括胸苷-ADPr（1a/b）和寡核苷酸-ADPr（2A-C）。通过化学选择性糖基化策略成功构建了关键的N³-α-核糖胸苷，并结合P(III)–P(V)焦磷酸组装技术实现了T-α-ADPr的毫克级制备。开发的固相合成方法首次实现了天然序列ADP-核糖基化DNA探针（如TCT-ADPr-C）的化学合成，解决了酶法制备底物数量有限、序列受限的难题。利用合成探针系统揭示了DarG和TARG1等水解酶对α构型和寡核苷酸底物的特异性识别机制，为研究核酸ADPr在细菌防御（如DarTG系统）、抗生素生产（SCO6735）和人类疾病（TARG1相关神经退行性疾病）中的功能提供了关键技术平台。这些化学工具将促进新型ADPr检测方法开发、读者蛋白鉴定和抑制剂设计等后续研究，推动对核酸ADPr生物学功能的深入探索。