一种基于CRISPR/Cas12a技术的BioLayer干涉生物传感器，用于快速且特异性地检测HPV16和HPV18病毒

《Microchemical Journal》：A CRISPR/Cas12a-mediated BioLayer interferometry biosensor for rapid and specific detection of HPV16 and HPV18

CRISPR/Cas12a结合生物层干涉法实现HPV16/18的高灵敏度快速检测，无需扩增且避免气溶胶污染，特异性提升并缩短至40分钟。

　　

张学谦|张凯妮|傅永东|傅善智|张璐璐|陈雷

中国山东省济南市山东师范大学生命科学学院动物抗性生物学重点实验室

摘要

近年来，人乳头瘤病毒（HPV）的感染与宫颈癌发病率的增加有关。由于HPV16和HPV18感染占所有宫颈癌病例的一半以上，检测这些病毒对于预防宫颈癌至关重要。在这项研究中，我们报道了一种基于CRISPR/Cas12a的生物传感器，用于生物层干涉测量（BLI）技术，能够快速且特异性地检测HPV16和HPV18。传统的BLI核酸检测方法中的加法信号被转化为减法信号，有效减少了假阳性结果，并提高了反应的特异性。此外，本研究还设计了一种探针-金纳米粒子偶联物以进一步提高检测灵敏度。该方法可以在40分钟内检测到低至460 fM和500 fM的HPV16和HPV18，无需扩增过程，避免了气溶胶污染，并具有高特异性。这种方法为HPV16和HPV18的快速、灵敏和定性检测提供了可行的解决方案。

引言

宫颈癌是全球女性中最常见的癌症之一。每年约有50万例宫颈癌被诊断出来，死亡率接近50% [1]。宫颈癌主要由人乳头瘤病毒（HPV）引起 [2]。根据不同的致病风险，HPV被分为高风险（HR）和低风险（LR）类型。在高风险类型中，HPV16和HPV18导致了全球近75%的宫颈癌病例 [3]。通过细胞学筛查和HPV筛查可以有效地预防和控制宫颈癌的发生 [4,5]。HPV DNA的检测已被广泛使用，因为它简单、方便、灵敏度很高，并且可以有效地对HPV进行分型 [6]。

目前，聚合酶链反应（PCR）是HPV诊断的金标准 [7]。尽管PCR具有灵敏度和可靠性，但它需要复杂的温度变化过程，且结果依赖于凝胶电泳 [8]。近年来，一些等温技术，包括滚环扩增（RCA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导的等温扩增（LAMP），已在病原体检测中得到广泛应用 [9]。等温扩增技术操作简便且灵敏度高，但容易受到气溶胶污染的影响，可能导致假阳性结果 [10]。为了实现更准确和严格的HPV检测，人们开发了多种基于生物传感器的检测方法。例如，张等人提出了一种基于CRISPR/Cas12a系统的新型双荧光/比色比率生物传感器，检测限低至300 fM [11]。然而，其检测时间长达140分钟，这在一定程度上限制了该传感器在实际应用中的效率和便利性。鲍等人开发了一种多重RPA/CRISPR-Cas12a集成生物传感器，能够同时检测八种HPV基因型，并在50分钟内实现单拷贝水平的灵敏度检测 [12]。但在实际应用过程中，仍需注意RPA过程中可能出现的非特异性扩增和气溶胶污染问题。甄等人开发了一种基于DNA步行者信号放大策略的CuFe2O4@T-COF纳米球介导的生物传感平台，检测限仅为1.37 × 10^?7 μmol/L [13]。然而，在追求更高灵敏度检测的应用场景中，这一检测限可能难以满足实际需求。现有的HPV检测方法仍存在一定的局限性。因此，迫切需要开发一种检测时间短、灵敏度高且无假阳性结果的检测方法，以实现高效准确的HPV检测，并为临床诊断和治疗提供更可靠的技术支持。

CRISPR及相关Cas蛋白的进步扩展了它们在核酸病原体诊断中的作用 [14]。当CRISPR RNA（crRNA）与特定目标序列配对时，Cas蛋白被激活，并在目标上进行顺式切割和反式切割 [15],[16],[17]。由于其高度敏感的单碱基识别能力，CRISPR/Cas系统已成为一种非常有效的分子诊断工具 [18]。作为一种无标记方法，生物层干涉测量（BLI）能够实现实时生物分子相互作用分析 [19]。该方法依赖于内部参考层与生物传感器尖端固定的生物分子之间产生的白光干涉图案 [20]。将生物传感器尖端浸入含有分析物的孔中，使溶液中的分子与固定的识别元件结合 [21]。这一特点使其具有更高的通量潜力 [22]。BLI技术已与CRISPR技术结合用于双链DNA的检测 [23]。然而，CRISPR-BLI技术在实际应用中仍存在某些局限性，灵敏度有限，尚未得到广泛有效的应用。近年来，由于金属纳米粒子（尤其是金纳米粒子（AuNPs）独特的性能优势，它们在传感器领域得到了广泛应用 [24]。使用冷冻标记方法开发的AuNPs生物探针进一步推动了基于CRISPR的检测方法的发展 [28]。将具有信号放大能力的AuNPs引入CRISPR-BLI系统可以有效解决灵敏度低的问题，并在病原体检测领域展现出广泛的应用前景。

近年来，结合重组酶聚合酶扩增和聚合酶链反应等预扩增技术的CRISPR检测方法在生物医学检测领域引起了广泛关注 [29],[30],[31]。尽管这些方法通过预扩增步骤显著提高了检测灵敏度，但预扩增过程不可避免地增加了气溶胶污染的风险 [32]，这可能导致非特异性结合，从而产生假阳性结果。这在一定程度上限制了预扩增依赖型CRISPR检测方法在结果准确性要求极高的场景（如临床诊断）中的广泛应用。因此，出现了无需扩增的CRISPR/Cas检测策略，包括CRISPR-Cas12a级联系统（CasSPORT）[33]、电化学发光 [34,35]、侧向流动测定 [36]、微流控芯片 [37] 和表面等离子体共振（SPR）[38]。

本研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a的生物层干涉测量（BLI）系统来检测HPV16和HPV18：1) 该技术通过量化光纤尖端的光学厚度变化来测量分子相互作用，信号强度与结合的分子密度相关。在本研究中，使用AuNPs来放大信号，解决了BLI在临床应用中低目标浓度时信号较弱的问题。2) 传统BLI中的加法信号被转化为减法信号。利用Cas12a的切割活性切割AuNP探针，从而减少了光纤尖端的光学厚度，产生了不受背景噪声（如非特异性吸附）影响的减法信号。3) 该方法无需扩增，减少了气溶胶污染，对于快速、灵敏和特异性的HPV检测具有重要意义。

部分摘录

生物安全与伦理批准

本研究完全符合国际和机构伦理标准。所有程序均遵循世界医学协会的《赫尔辛基宣言》中关于人类研究的规定，并获得了山东师范大学生命科学学院伦理委员会的批准。在实施前获得了必要的监管许可，以确保参与者的安全和伦理严谨性。

样品制备

所有病毒样本均来自济南的一家综合医院

CRISPR-BLI生物传感器的原理

CRISPR-BLI使用96孔板存储试剂，实验参数（如实验温度和反应时间）设置完成后，整个实验实现了自动化。CRISPR-BLI策略如图1A和B所示。实验过程包括三个步骤：第一步：报告基因DNA的固定。在实验开始时，在PBSP中建立了稳定的基线信号λ0。为了验证信号生成效果，本研究设计了两种探针结构：H1（100 nM）：一个25-bp的

讨论

本研究描述了一种利用CRISPR/Cas12a和BLI技术的CRISPR-BLI生物传感器，实现了灵敏、特异且无需扩增的检测。在该传感器中，H1-H2-AuNPs被固定在传感器光纤探针的表面。crRNA识别目标基因并激活Cas12a的反式切割活性，从而切割探针的双链DNA区域。与双链DNA序列结合的AuNPs有效放大了检测信号。大多数现有的BLI生物传感器产生的是加法信号

结论

本研究设计、测试并验证了一种用于检测HPV16和HPV18的CRISPR/Cas12a介导的BLI生物传感器。该传感器可以在40分钟内检测到低至460 fM和500 fM的HPV16和HPV18。该方法对HPV16和HPV18的特异性非常好。我们使用CRISPR-BLI和qPCR检测了16个临床样本，结果完全一致，证明了其实用性和可靠性。

作者贡献声明

张学谦：撰写——原始草稿，实验研究。张凯妮：撰写——原始草稿，验证。傅永东：验证，软件开发，数据管理。傅善智：资源支持。张璐璐：撰写——审稿与编辑，方法学设计，概念构建。陈雷：撰写——审稿与编辑，方法学设计，概念构建。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2022YFC3400700）和济南市校际融合发展计划（JNSX2023031）的支持。