《Poultry Science》：Regulatory Effects of Inositol 1,4,5-trisphosphate Receptor Genes Knockdown on Intracellular Ca2? Concentration and Ion Channel–Related Gene Expression in Duck Uterine Epithelial Cells
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本研究针对IP3R在鸭子宫上皮细胞钙离子转运网络中的调控机制尚不明确的问题，通过shRNA干扰技术分别敲低IP3R1、IP3R2和IP3R3基因的表达。结果显示，IP3R敲低显著提高了细胞内Ca2?浓度，并下调了TRPV6、ORAI1、ATP2B1等多个离子通道相关基因的表达。该研究为阐明蛋鸭蛋壳钙化分子机制提供了新证据。
在产蛋家禽中，尤其是蛋鸭，子宫上皮细胞在蛋壳形成过程中扮演着至关重要的角色，负责将血浆中的钙离子转运至子宫腔。这一过程依赖于精确的细胞内钙离子浓度调控。钙离子作为重要的第二信使，其浓度的微小波动即可影响细胞分泌、增殖、分化及基因转录等多种生命活动。内质网是细胞内主要的钙库，而肌醇1,4,5-三磷酸受体是内质网膜上主要的钙离子释放通道。IP3R家族包括三种亚型，它们在亲和力、调控机制和组织分布上存在差异。然而，在蛋鸭子宫上皮细胞中，这三种IP3R亚型如何协同或独立调控细胞内钙信号及下游离子通道网络，从而影响钙稳态和蛋壳矿化，其具体分子机制尚不完全清楚。为了解决这一问题，研究人员在《Poultry Science》上发表了他们的最新研究成果。
为了开展研究，研究人员首先从处于产蛋高峰期的三穗鸭分离并培养了原代子宫上皮细胞，并通过细胞角蛋白免疫荧光染色进行了鉴定。研究的关键技术方法包括：设计并构建了针对IP3R1、IP3R2和IP3R3的特异性shRNA干扰载体；利用脂质体转染法将shRNA载体导入子宫上皮细胞，建立了单基因敲低、双基因敲低和三基因敲低的细胞模型；采用Fluo-3/AM荧光探针标记并通过荧光显微镜和酶标仪检测了细胞内Ca2?浓度；通过实时荧光定量PCR技术分析了10个离子转运相关基因的mRNA表达水平；并使用统计学方法分析了基因表达与钙离子浓度之间的相关性。
Sequencing of positive clones
通过DNA测序比对，证实成功构建了针对IP3R1、IP3R2和IP3R3的shRNA干扰载体。
Specificity verification of RT–qPCR primers for IP3Rs
琼脂糖凝胶电泳显示常规PCR产物为单一、明亮的特异性条带，表明RT-qPCR引物具有良好的特异性。
Isolation and Identification of Primary Uterine Epithelial Cells in Ducks
成功分离和培养了鸭原代子宫上皮细胞，细胞呈现典型的铺路石样形态，并通过细胞角蛋白免疫荧光染色证实了其上皮细胞身份。
Screening of Optimal shRNA Expression Vectors Targeting IP3R Genes
通过RT-qPCR分析，筛选出对IP3R1、IP3R2和IP3R3干扰效率最高的shRNA载体，干扰效率均达到约70%。
Measurement of intracellular Ca2?? concentration in duck uterine epithelial cells
转染48小时后，Fluo-3/AM探针检测发现，所有IP3R敲低处理组的细胞内Ca2?浓度均显著高于阴性对照组。
The mRNA expression of ion transport–related genes
RT-qPCR结果显示，在多个IP3R敲低组中，TRPV6、ORAI1、SCNN1G、SLC8A1、ATP2B1和ATP2A2等基因的表达量相较于NC组显著下调。
Correlation Between Ion Transport–Related Gene Expression and Intracellular Ca2?? Levels
相关性分析表明，这些离子通道相关基因的表达水平与细胞内Ca2?浓度存在显著的相关性，包括正相关和负相关。例如，在IP3R1敲低组中，TRPV6、ORAI1和SCNN1G与Ca2?浓度呈负相关；而在IP3R2敲低组中，ATP2B1与Ca2?浓度呈正相关。
本研究得出结论，敲低IP3R基因不仅抑制了鸭子宫上皮细胞的内质网钙释放，导致细胞内Ca2?浓度升高，还改变了多种离子通道相关基因的转录水平。这些基因表达的变化与细胞内Ca2?水平显著相关，揭示了IP3R亚型在协调钙稳态和离子转运网络中可能存在功能特异性与互补性。该研究结果为了解蛋鸭子宫上皮细胞钙离子调节机制提供了新的分子证据，对深入理解蛋壳矿化过程以及未来通过分子遗传策略改善蛋壳品质具有重要的理论意义。
