《Synthetic and Systems Biotechnology》：Integrated amplification of NADPH-regenerating modules enhances cytidine biosynthesis in
Escherichia coli
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本研究针对大肠杆菌胞苷生物合成中NADPH供应不足这一关键代谢瓶颈，通过CRISPR-Cas9介导的多重基因组编辑技术同步增强膜结合转氢酶（pntAB）、氧化磷酸戊糖途径（zwf）和脱羧支路（gnd）三个NADPH再生模块。工程菌株NXBG-20在500 mL摇瓶发酵54小时后，胞苷产量达到7.83 g/L，较出发菌株提高9.10倍。多组学分析表明该策略通过重构代谢网络，引导碳流向核苷前体物质定向富集，为微生物制造高附加值核苷产品提供了新范式。
在生物制造领域，胞苷作为医药和食品工业不可或缺的核苷类物质，其全球需求持续增长。传统化学合成法存在环境污染问题，而微生物发酵技术凭借可再生底物和环境友好特性成为主流生产方案。然而在大肠杆菌的胞苷生物合成路径中，辅因子失衡问题长期制约着产量提升，其中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的供应不足尤为突出。作为细胞生物合成的重要还原力，NADPH参与多种细胞内反应，其短缺直接限制代谢通量。尽管前人通过外源添加NADPH前体或强化磷酸戊糖途径（PPP）等策略部分缓解了这一问题，但单一模块的增强常引发代谢补偿效应，导致效果受限。
为突破这一瓶颈，宁夏大学研究团队在《Synthetic and Systems Biotechnology》发表研究，提出整合式NADPH再生模块协同放大策略。该研究通过CRISPR-Cas9介导的多重基因组编辑技术，同步强化三个关键NADPH再生模块：膜结合转氢酶（pntAB）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（zwf）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（gnd）。研究人员使用强组成型启动子Ptrc替换天然启动子，构建了系列工程菌株NXBG-18（pntAB增强）、NXBG-19（pntAB-zwf共增强）和NXBG-20（pntAB-zwf-gnd三重增强）。RT-qPCR验证显示目标基因转录水平显著上调。
关键技术方法包括：利用CRISPR-Cas9系统进行启动子替换；通过实时定量PCR和转录组学分析基因表达；采用摇瓶发酵结合高效液相色谱（HPLC）检测胞苷产量；使用酶标法测定NAD(P)H和ATP含量；整合转录组与蛋白质组数据进行多组学关联分析。
研究结果揭示：
3.1. 多重NADPH模块工程增强胞苷产量
工程菌株在保持正常生长动力学的同时，胞苷产量实现跨越式提升。NXBG-20菌株产量达7.83±0.09 g/L，较出发菌株提高9.10倍，且葡萄糖消耗速率提升至1.72±0.13 g/L/h，表明代谢活性未受损害。
3.2. 协同辅因子工程提升NADPH供应
辅因子测定显示工程菌株NADPH/NADP+比率显著改善，NXBG-20提升3.76倍。ATP含量同步增加2.55倍，反映能量代谢与还原力供给的协同优化。转录组发现苹果酸酶（maeB）和NAD+激酶（nadK）基因表达分别上调13.56倍和5.11倍，表明存在代谢再平衡机制。
3.3. 转录组学揭示代谢网络重构
比较转录组发现238个差异表达基因，其中64个上调、174个下调。EMP途径基因（fbaB、pykA）和ED途径基因（edd、eda）表达抑制，而磷酸转运系统基因（pstS）和葡萄糖PTS转运蛋白基因（glvC）上调，体现碳流向PPP的定向迁移。
3.4. 蛋白质组学验证代谢重编程
57个差异表达蛋白中28个上调、29个下调。PPI分析显示精氨酸琥珀酰转移酶途径蛋白（astB/C/E）形成互作网络，可能通过补充TCA循环中间体和氮源供应间接支持核苷合成。
3.5. 多组学整合揭示代谢协调机制
九象限分析显示31个基因在转录与蛋白水平变化一致。KEGG富集突出碳代谢、氧化磷酸化等通路重构。研究绘制出以NADPH为核心的资源再分配蓝图：PPP通量增强提供核苷前体，苹果酸酶维持氧化还原稳态，精氨酸代谢优化氮源利用。
该研究通过系统级代谢工程策略，成功破解胞苷生物合成中的辅因子限制难题。工程菌株NXBG-20的胞苷产量创摇瓶培养新高，且多组学分析揭示了代谢网络的重构规律。这种整合NADPH再生模块的方法不仅为核苷类药物生物制造提供新平台，更深化了对辅因子驱动代谢通量控制机制的理解，为微生物细胞工厂的精准设计提供理论支撑。
