海洋假交替单胞菌天然产物挖掘新利器：RECC基因编辑系统的开发与应用

《Synthetic and Systems Biotechnology》：RECC: A Red/ET–CRISPR/Cas9-based system enabling genome mining of marine Pseudoalteromonas for novel natural products

本文推荐一种名为RECC的新型基因编辑系统，该系统将Red/ET重组工程与CRISPR/Cas9技术巧妙结合，成功解决了海洋细菌Pseudoalteromonas因电转效率低而难以进行遗传操作的难题。研究人员利用该系统激活了P. flavipulchra DSM 14401中一个沉默的NRPS-PKS杂合基因簇，发现了新型环脂肽类化合物flavipulchrins。这项工作为挖掘海洋微生物中“隐蔽”的天然产物提供了强大且通用的工具，具有重要的方法论意义。

　　

海洋，覆盖地球表面超过70%的广阔疆域，孕育着数量庞大、种类繁多的微生物资源。这些微生物为了适应高压、高盐、低温等独特的海洋环境，进化出了非凡的生物合成能力，能够产生结构新颖、活性多样的天然产物，为新药研发提供了宝贵的化合物库。然而，一个令人困扰的“沉默”现象极大地限制了我们对其潜力的挖掘：绝大多数海洋微生物的生物合成基因簇在常规实验室培养条件下处于不表达或低表达状态。更为棘手的是，许多海洋微生物，包括在海洋微生物群落中占比高达20%–60%的假交替单胞菌属，由于其细胞壁结构、胞外多糖基质以及限制性内切酶修饰系统等适应性特征，导致其遗传操作异常困难，特别是依赖电穿孔的基因编辑方法效率极低。这种遗传上的“顽固性”成为了激活这些“宝藏”基因簇、发现新化合物的主要瓶颈。

为了破解这一难题，发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》上的研究论文《RECC: A Red/ET–CRISPR/Cas9-based system enabling genome mining of marine Pseudoalteromonas for novel natural products》报道了一种创新的解决方案。研究人员开发了一种名为RECC的集成式基因编辑系统，该系统巧妙地将Red/ET同源重组的高效性与CRISPR/Cas9基因编辑的精准计数筛选能力相结合，旨在实现对海洋假交替单胞菌等难转化微生物的高效、无缝（无标记）基因组编辑。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：首先，通过生物信息学分析从假交替单胞菌中筛选并获得特异性Red/ET重组酶基因；其次，构建了单质粒RECC系统，该系统将CRISPR/Cas9与Red/ET重组酶表达盒整合，并优化了同源臂与向导RNA的组装策略，实现了一步吉布森组装；再者，利用接合转移而非电转的方式将编辑质粒导入模式菌株P. flavipulchra DSM 14401（菌株来源于德国微生物菌种保藏中心DSMZ）中；最后，通过超高效液相色谱-高分辨质谱和核磁共振波谱等技术对激活产生的代谢产物进行分离和结构鉴定。

3.1. 在P. flavipulchra DSM 14401中建立Red/ET系统

研究人员首先尝试建立基于Red/ET重组酶的基因编辑方法。通过同源序列比对，他们从P. agarivorans Hao 2018菌株中鉴定并合成了一个Red/ET重组酶系统（Redαβ2018）。然而，对7种假交替单胞菌的电转效率测试发现，除DSM 14401外，其他菌株均表现出极强的电转抗性。即使对DSM 14401进行培养基、缓冲液和预培养时间等条件优化，其最高电转效率也仅为约10²CFU/μg DNA，远低于有效重组工程所需的阈值（通常需10⁴至10⁵CFU/μg DNA）。进一步研究发现，低效率可能与菌株分泌的胞外DNA酶对质粒DNA的快速降解有关。此外，研究人员评估了四种诱导型启动子（P_tet, P_BAD, P_tac, P_Rha）在DSM 14401中的性能，最终选择泄漏低、诱导效率高的四环素诱导型启动子P_tet来控制重组酶的表达。尽管成功构建了重组酶表达质粒，但由于电转效率过低，未能获得预期的重组子，这表明单纯依赖Red/ET系统在DSM 14401中难以实现有效编辑。

3.2. 在P. flavipulchra DSM 14401中建立和优化RECC系统

为了克服电转效率的限制，研究人员将CRISPR/Cas9系统与Redαβ2018重组工程耦合，利用Cas9蛋白对未成功编辑的野生型细胞进行计数筛选，从而无需依赖高效率的电转和抗生素标记筛选。他们首先验证了CRISPR/Cas9系统在DSM 14401中的编辑效率，以一个高丰度的表层蛋白基因作为编辑靶点，成功实现了高效敲除。然而，也观察到了CRISPR逃逸现象，即部分细胞未能被Cas9有效清除。通过对逃逸菌株的Cas9基因和靶位点序列进行分析，未发现常见的突变机制，推测DSM 14401可能存在未知的逃逸途径。

随后，研究人员构建了将Redαβ2018与CRISPR/Cas9整合的单质粒RECC系统。通过优化同源臂的长度，发现当同源臂长度达到100 bp时，编辑效率可超过20%。更重要的是，他们对质粒构建流程进行了重要改进，将同源臂直接连接在向导RNA的5‘端前，使得整个编辑质粒（包含Cas9、重组酶、同源臂和sgRNA）只需一步吉布森组装即可完成，大大简化了操作流程。实验证明，这种设计不影响CRISPR/Cas9的功能，且Red/ET重组酶的存在对于同源重组的发生至关重要。

3.3. RECC介导的DSM 14401中隐蔽BGC的激活

在成功建立高效、简便的RECC基因编辑平台后，研究人员利用其开展基因组挖掘。他们选择DSM 14401中一个预测编码脂肽类化合物的非核糖体肽合成酶-聚酮合酶杂合基因簇（命名为Pfl簇）作为靶点。通过RECC系统，将该基因簇的天然启动子替换为来自P. flavipulchra S16的强组成型启动子P₁₈，成功获得了启动子替换菌株（DSM 14401::P₁₈_Pfl），编辑成功率超过50%。作为对照，他们同时利用CRISPR/Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）构建了该基因簇的敲除菌株（DSM 14401ΔPfl），发现DSM 14401中的NHEJ主要表现为大片段的缺失，而非碱基的插入或缺失。

代谢产物分析显示，与野生型和敲除菌株相比，启动子替换菌株在多种培养基（2216E, PYG, CY）中均产生了一系列新的色谱峰，表明Pfl基因簇被成功激活。值得注意的是，这些新化合物在野生型菌株中也有微量存在，提示该基因簇在实验室条件下呈低水平表达。

3.4. 脂肽flavipulchrins的结构解析

研究人员从6升发酵液中分离纯化得到了两个主要化合物flavipulchrin A (1) 和 B (2)。通过高分辨质谱、一维和二维核磁共振波谱（包括¹H NMR, ¹³C NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC）等技术，解析了它们的化学结构。结果表明，这两个化合物均为环状脂肽，包含一个由甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、亮氨酸和精氨酸组成的七肽环，以及一个连接在N端的3-氨基脂肪酸链（1为3-氨基十二酸，2为3-氨基十一酸）。其中一个天冬酰胺残基的β位被羟基化。通过Marfey's assay结合生物信息学分析，确定了大部分氨基酸的立体构型为L型，但亮氨酸为D型。令人意外的是，β-羟基天冬酰胺的构型被确定为(2R,3S)即D-构型，而其生物合成模块中并未发现常见的差向异构化结构域，这暗示了一条新的氨基酸差向异构化途径。

3.5. Flavipulchrins的生物合成途径推测

结合Pfl基因簇的组成和化合物结构，研究人员推测了flavipulchrins的生物合成途径：起始于一个酰基辅酶A连接酶/合成酶结构域加载壬酸或癸酸作为起始单元，随后经过一个聚酮合酶模块延伸并引入氨基，形成3-氨基脂肪酸链。接着，多个非核糖体肽合成酶模块依次装配七个氨基酸。其中，一个独立的TauD/TfdA家族双加氧酶PflD可能负责天冬酰胺残基β位的羟基化，并且可能也参与了其差向异构化过程。最后，硫酯酶结构域催化七肽环的C末端与3-氨基脂肪酸的氨基形成大环内酰胺，完成环化。

3.6. 生物活性测定

对flavipulchrin A和B进行了抗菌活性测试，结果显示在高达1 mM浓度下，其对所选测试菌株（包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等）均未表现出明显的抑制活性。

综上所述，本研究成功开发了RECC这一创新的基因编辑平台，有效克服了海洋假交替单胞菌遗传操作难的瓶颈。该系统的核心优势在于其单质粒设计、不依赖电转和选择标记、以及操作流程的极大简化。应用RECC系统，研究人员成功激活了P. flavipulchra DSM 14401中的一个隐蔽生物合成基因簇，并发现了一类结构新颖的环脂肽flavipulchrins。特别值得注意的是，对这些化合物生物合成途径的分析揭示了一个潜在的、前所未见的D-型β-羟基天冬酰胺生物合成机制，凸显了海洋微生物次级代谢途径的独特性和新颖性。

尽管所发现的化合物在初步活性筛选中未显示抗菌活性，但其新颖的结构本身就具有重要的化学价值，且不排除其可能具有其他尚未测试的生物功能。更重要的是，RECC系统的建立其意义远不止于发现几个新分子。它为解决非模式微生物，特别是来自特殊环境的微生物的遗传操作难题提供了一个通用、高效的策略。这项研究不仅为深度挖掘假交替单胞菌属乃至其他海洋微生物的巨大生物合成潜力打开了大门，也为利用合成生物学手段开发这些微生物的应用价值奠定了坚实的技术基础。未来，通过对RECC系统效率的进一步优化（如阐明其CRISPR逃逸机制）以及将其推广至更多难以进行遗传操作的微生物类群，必将加速我们从这些“沉默的宝藏”中解锁更多具有应用前景的天然产物和酶资源。