《International Journal of Molecular Sciences》：Co-Immunoprecipitation-Coupled Mass Spectrometry Analysis of Zyxin’s Interactome and Phosphosites in Early Xenopus laevis Development
蛋白质复合物作为分子机器驱动发育过程，其中支架蛋白介导的组装机制尤为关键。机械敏感适配蛋白Zyxin是典型代表，能够整合肌动蛋白细胞骨架动力学与基因表达。然而，其相互作用与翻译后修饰在发育过程中的动态调控机制尚不明确。本研究通过结合免疫共沉淀（Co-IP）与定量质谱分析（包括数据依赖性采集DDA和数据非依赖性采集DIA），系统描绘了非洲爪蟾（Xenopus laevis）早期三个发育阶段（从原肠胚到神经胚）中Zyxin相互作用组及磷酸化位点的动态图谱。
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结果
2.1. 动态Zyxin相互作用组图谱构建策略
为解析Zyxin蛋白相互作用网络在发育过程中的阶段性变化，研究团队从非洲爪蟾胚胎三个关键发育阶段（早期原肠胚Stage 10、早期神经胚Stage 14、晚期神经褶Stage 16）的裂解液中进行了Co-IP实验。采用经验证的靶向Zyxin N端和C端的抗体混合物，以最大限度地捕获天然复合物，并使用非特异性兔IgG作为阶段匹配的阴性对照。Western blot分析证实了Zyxin在所有阶段均被高效且特异性地免疫沉淀。
通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对免疫沉淀复合物进行分析，并采用两种互补的采集策略：DDA用于深度相互作用组发现，DIA用于跨发育阶段的准确无标记定量。每个阶段设置两个独立生物学重复，并利用这两种方法进行处理。由于Zyxin是大型大分子组装体（如整合素粘附体）的核心组分，该Co-IP/MS方法捕获了直接和间接的相互作用蛋白。为确保生物学相关性，后续分析聚焦于与Zyxin功能有明确联系的蛋白质。
2.2. Zyxin为中心的粘附体核心稳定而外周相互作用动态变化
定量质谱分析揭示了一个保守的高亲和力核心复合物。典型的粘着斑（Focal Adhesion, FA）连接蛋白Talin（tln1, tln2）和Vinculin（vcl）在所有阶段均被特异性富集，证实了它们作为Zyxin相互作用组内稳定、直接适配体的作用。与此形成鲜明对比的是，关键的整合素亚基（itga5, itgb1）虽被检测到，但在任何阶段与IgG对照相比均未显示特异性富集。这一结果直接验证了已建立的粘附体结构，即Zyxin与整合素的连接是间接的，由稳定的Talin-Vinculin机械连接介导。
与Zyxin在细胞骨架组织中的主要作用一致，研究观察到中心肌动蛋白结合蛋白的显著共沉淀。细胞质β-肌动蛋白（actb）和交联α-辅助动蛋白（actn1, actn4）形成了一个稳定的、组成型的界面。跨阶段的定量富集热图分析显示，主要细胞骨架调节因子被招募到Zyxin复合物中是受发育调控的。值得注意的是，许多核心相互作用蛋白的特异性富集在原肠胚开始时期（Stage 10）最低。这种模式在神经胚形成时期（Stage 14-16）发生显著变化，观察到关键调节因子共沉淀的显著阶段性放大，包括α-辅助动蛋白亚型、Talin和非肌肉肌球蛋白II重链（myh9, myo10）。经典的Zyxin效应因子VASP（vasp）是所有阶段中最一致且特异性富集的伙伴之一。
这些数据共同描绘了Zyxin相互作用组的双重结构：一个不变的机械核心（Talin, Vinculin, Actin）确保其稳定整合到粘附-细胞骨架网络中；同时，发育调控的肌动蛋白交联（α-Actinin）和肌球蛋白收缩性（Myosin II）调节因子的招募在神经胚形成时期达到高峰。这种相互作用组的阶段性放大与神经管形成所需的强烈机械需求和细胞骨架重塑相吻合，表明Zyxin在活跃的形态发生过程中作为力响应复合物的成核支架。
2.3. 阶段特异性DNA结合转录因子相互作用
Zyxin可穿梭至细胞核并作为转录支架发挥作用。此前酵母双杂交筛选已发现Zyxin的LIM结构域与关键发育转录因子之间存在相互作用。本研究通过内源性Co-IP/MS，评估了这些相互作用在胚胎原生环境中的发育动力学。
DDA质谱分析揭示了与YBX家族成员的阶段性相互作用。在早期原肠胚阶段（Stage 10），Zyxin与由Ybx1和Ybx2共享的保守肽段以及Ybx2特有的肽段共同沉淀。到早期神经胚阶段（Stage 14），仅检测到保守的特征肽段NGYGFINR。定量DIA分析明确鉴定了Ybx1、Ybx2因子与Zyxin的特异性关联，并在发育阶段14观察到最特异的信号。
对于先前已确认的伙伴转录因子Gli1，观察到一个独特的时间模式。Gli1在阶段10或14的Zyxin复合物中未被检测到。然而，在阶段16，在DDA数据集中鉴定到了一个特定的Gli1肽段（LGLLDGR，残基226-232）。这一结果表明了Zyxin与Gli1之间存在晚期阶段特异性的关联，与神经模式形成过程中Hedgehog信号通路活性高峰一致。
内源性Co-IP/MS分析绘制了Zyxin与特定转录因子关联的发育时序图，揭示了高度动态、阶段限制性的相互作用。先前已确立的与Y-box蛋白的联系是瞬时的，在原肠胚形成和早期神经胚形成时期达到高峰，在阶段16之前停止。相反，经生化验证的与Sonic hedgehog效应因子Gli1的相互作用特异性地出现在晚期神经褶阶段，与神经模式形成过程中Hedgehog信号通路的高峰期相吻合。这些不同的时间分布表明，Zyxin作为一个发育编程的支架，在形态发生转换阶段组装特定的转录复合物。
2.4. Zyxin亚型与磷酸化的发育调控
磷酸化是调控Zyxin支架功能的关键。为了绘制其在非洲爪蟾早期发育过程中的磷酸化动力学图谱，研究采用了互补的质谱策略。
阶段和亚型特异的N端调节域磷酸化。初步DDA分析在与人源Ser142同源的N端区域鉴定到两个不同的磷酸肽。这些肽段源自具有不同起始密码子的不同Zyxin亚型，导致不同的氨基酸编号。将序列与全长蛋白质结构比对显示，两个肽段中被磷酸化的丝氨酸对应于N端调节域内相同的保守结构位置。
定量DIA分析精确解析了两种N端磷酸化形式的发育动力学，揭示了不同的、亚型特异性的调控。对于源自亚型A0A8J1LC30/A0A974H9B9的磷酸肽（"4P"肽段，pSer250），其磷酸化化学计量在原肠胚形成到神经胚形成期间急剧下降，表明在该亚型组中早期形态发生期间存在显著的磷酸化下调。对源自亚型A5H447的磷酸肽（"3P"肽段，pSer198）的分析揭示了一个独特的时间模式：它在阶段10完全磷酸化，但其磷酸化/非磷酸化比率在后期阶段明显下降。因此，尽管保守N端位点的磷酸化在两种主要亚型中均被逐步下调，但时间点不同。
DIA揭示了DDA检测范围之外的复杂磷酸化景观。DIA的增强灵敏度对于绘制N端以外的磷酸化至关重要。对中心域肽段SLGPQTESGRSPGAQSTGGK的分析揭示了在所有阶段Ser376和Ser383的组成型磷酸化，以及保守的Ser386的发育调控磷酸化（存在于阶段10和14，但在阶段16缺失）。最值得注意的是，DIA独特地鉴定了第一个LIM结构域内的低丰度双重磷酸化（肽段AGEHLYHVACFTCSR，pThr499/pSer501）。估计的化学计量极低，这解释了为什么这种新的调控位点未被灵敏度较低的DDA方法捕获。
N端磷酸化在核转运中的功能验证。为了探究已鉴定动态磷酸化位点的功能作用，进行了初步的结构-功能分析。研究人员在非洲爪蟾Zyxin的两个关键位点（阶段特异性调控的N端Ser198和保守的中心Ser386）上构建了磷酸化缺陷（S198A, S386A）和磷酸化模拟（S198D, S386D）突变体。在胚胎中表达这些突变体并未引起明显的形态缺陷，但细胞分级分离实验揭示了N端位点的特定作用。虽然Ser386的突变并未改变Zyxin的核质分布，但S198A和S198D突变均显著损害了其核积聚。这一结果表明，Ser198的可磷酸化状态，而非简单的电荷模拟，对于有效的核输入至关重要。这一发现与哺乳动物细胞中已确立的分子机制一致，即同源位点的磷酸化创建了14-3-3蛋白的结合位点，从而促进核转位。
磷酸化蛋白质组学分析揭示，Zyxin在发育过程中受到复杂的、多层次的调控。磷酸化具有结构域特异性、亚型特异性和阶段特异性。N端调节位点在早期最活跃，而中心区域在后期获得独特的修饰。LIM结构域内磷酸化的发现提示了一种直接调节Zyxin支架功能的新机制。这些动态模式将磷酸化定位为一个核心机制，在不同形态发生事件中微调Zyxin作为机械敏感枢纽的作用。
2.5. Zyxin与激酶、凋亡调节因子和信号转导子的相互作用
为了阐明调控Zyxin磷酸化和功能的潜在机制，分析了在发育阶段中与Zyxin共沉淀的激酶和调节蛋白。分析聚焦于一组经过筛选的、在文献中已确立与Zyxin有直接相互作用的蛋白质。
研究数据与已确立的磷酸化通路相吻合并进行了扩展。在人类细胞中，AKT激酶磷酸化Zyxin的Ser142，产生14-3-3蛋白的结合位点。这种相互作用促进Zyxin的核转位和与Acinus的复合物形成，从而抑制凋亡。在本非洲爪蟾研究中，AKT2亚型在Zyxin复合物中被特异性检测到，尤其在阶段10最为显著。这种时间上的关联与同源位点的高磷酸化信号相吻合，提示AKT在早期形态发生过程中调控Zyxin的保守作用。此外，多种14-3-3蛋白亚型在相互作用组中被稳健且特异性地富集，强有力地证实了体内Zyxin磷酸化与14-3-3结合之间的功能联系。
另一个关键的调控轴涉及细胞周期激酶。Zhou等人研究表明，细胞周期蛋白依赖性激酶1在细胞分裂期间磷酸化Zyxin以促进癌细胞增殖，并通过CDK8将Zyxin与转录共激活因子YAP联系起来。对细胞周期蛋白依赖性激酶1的分析揭示了其与Zyxin复合物关联的细微差别。虽然CDK1-A和CDK1-B亚型在阶段16可通过深度覆盖的DDA测序检测到，但它们在发育过程中的比较性DIA测量中未显示定量富集。这表明CDK1可能存在于广泛的Zyxin相关蛋白网络中，但在本实验捕获的条件下未形成稳定的、化学计量的复合物。
对其他细胞周期蛋白依赖性激酶的定量分析揭示了它们与Zyxin复合物的阶段特异性关联。CDK5和CDK13在发育阶段中显示出一致的、中等程度的富集。相比之下，CDK4的信号高度可变，在阶段16有显著的富集，提示了潜在的晚期阶段调控作用。虽然未发现CDK8，但其下游效应因子Yap1在阶段14和16被特异性共沉淀。这表明存在一个发育调控的Zyxin-YAP相互作用，可能独立于CDK8，值得进一步研究。
研究还鉴定了Zyxin复合物内的Caspase。Chan等人证明人源Zyxin是Caspase-3的体外底物。本研究提供了体内证据，因为Caspase-3.2以高特异性跨阶段与内源性Zyxin共沉淀，同时检测到较低水平的Caspase-6、-7和-10。这一发现强有力地支持了Caspase介导的切割在发育过程中Zyxin周转中的生理作用。
定量的Zyxin相互作用组将其定位在一个多方面的信号网络内。与AKT和CDK的阶段特异性关联与其磷酸化动力学相关。Zyxin与CDK的关系似乎是多方面的。这凸显了这些激酶对Zyxin的调控可能涉及短暂的、催化性的接触，这与定义其核心复合物的稳定支架相互作用不同。这种CDK介导的磷酸化对Zyxin在形态发生过程中活性的功能性结果值得进一步研究。与14-3-3蛋白和Caspase的稳定、高亲和力相互作用证实了其在存活和凋亡中的保守作用。最后，晚期出现的与YAP的联系突显了一条潜在通路，Zyxin可能通过该通路在胚胎发生过程中将机械或粘附信号转化为转录输出。
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讨论
分步定量蛋白质组学分析首次提供了早期脊椎动物形态发生过程中机械敏感支架蛋白Zyxin所含蛋白质复合物的动态图谱。数据显示该复合物并非静态实体，而是经历了精确的组成和翻译后重塑。这种动态行为受双组分结构原则支配：一个进化上保守的结构核心和一个动态招募的阶段特异性调控外围。
3.1. 保守核心与发育动态外围
一个核心发现是鉴定了一个不变的结构核心，其定义为在所有阶段中，必需的粘着斑适配体Talin和Vinculin与Zyxin一致且特异性地共免疫沉淀。这一观察结果通过间接连接将Zyxin牢固地锚定在经典整合素粘附体内，在胚胎背景下证实了来自哺乳动物细胞研究的生化模型。整合素本身弱的特异性富集与此已建立的模型相符。
形成鲜明对比的是，复合物的调控外围表现出显著的阶段特异性动态。在早期神经胚形成时期α-辅助动蛋白亚型的显著、瞬时招募标志着一个肌动蛋白交联和细胞骨架增强的时期，这是组织折叠的前提。同时，非肌肉肌球蛋白II显示出逐渐增加的关联，表明肌动球蛋白收缩性的定量、阶段依赖性微调。这种动态外围使复合物能够作为一个可调谐的枢纽，满足阶段特异性的机械需求。热图分析直观地总结了这一功能转换：在原肠胚和神经胚阶段之间，Zyxin相关复合物从以整合素粘附为中心转变为以肌动球蛋白为中心的组合，这与从密集的细胞迁移到形成稳定的、富含肌动蛋白束结构的过渡相关。
3.2. 具有功能性输出的多层磷酸化调控代码
整合分析揭示，Zyxin受到一个复杂的、发育定时的磷酸化代码的调控，该代码动态地适应发育阶段。通过采用互补的DDA和DIA质谱，研究人员绘制了以前无法获取的动态图谱。在保守的N端调节位点鉴定到了亚型特异性调控。这表明不同的Zyxin亚型受到不同的时间控制。突变分析证明，Ser198的可磷酸化状态对于有效的核输入至关重要，这为阶段特异性磷酸化如何调控Zyxin接近其核相互作用伙伴提供了直接的分子解释。除了N端，DIA还揭示了Ser376/Ser383的组成型磷酸化、Ser386的阶段调控磷酸化（到阶段16消失），以及第一个LIM结构域内一个新的、低丰度的磷酸化，提示了一个新的调控潜力层。这些动态模式共同将磷酸化定位为一个中央交换台，可能重新配置Zyxin相互作用组，以满足原肠胚形成和神经胚形成过程中不断变化的机械和信号需求。
3.3. Zyxin作为信号和转录调控的整合节点
除了其在细胞骨架重塑中的作用，相互作用组数据将Zyxin定位在更广泛的信号网络中的一个中心节点。14-3-3蛋白和Caspase的稳健共免疫沉淀为Zyxin与凋亡调控的物理连接提供了强有力的体内证据。与激酶如AKT2的关联将该复合物置于存活通路的交汇点。
此外，研究证明了Zyxin与DNA结合转录因子之间的阶段性相互作用。在原肠胚形成期间与Y-box蛋白的瞬时关联与母源-合子转换相关，而在晚期神经胚阶段Gli1的特异性共沉淀与神经模式形成过程中Hedgehog信号通路的高峰期一致。这些数据将细胞骨架枢纽与关键发育通路整合起来，支持了Zyxin作为时间支架的假说，即组装不同的转录模块以协调基因表达与形态发生进程。
3.4. 结论与意义
总之，整合分析将Zyxin从一个静态的结构组分重新定义为可发育重编程的信号枢纽。其相互作用组在结构上被组织成一个用于机械整合的稳定核心和一个用于调控输入的动态外围，其功能通过多层磷酸化调控代码进一步微调。通过作为一个动态界面，连接粘附位点与细胞骨架、凋亡机器和阶段特异性转录调节因子，Zyxin作为一个中央整合器出现，负责协调脊椎动物形态发生所必需的机械和生化线索。其关键相互作用的进化保守性强调了它们的基本重要性，并提示这种动态组装过程的失调可能导致以异常机械感应为特征的疾病状态。该资源为未来研究支架蛋白在发育和疾病中调控的逻辑提供了分子路线图。
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材料与方法
研究遵循了严格的实验流程。所有动物护理和处理均符合相关机构的规定。非洲爪蟾胚胎通过体外受精获得，并按照标准方法培养和分期。Zyxin的Co-IP使用经过验证的抗体从胚胎裂解液中完成，并使用Protein A Sepharose珠进行。通过SDC辅助的on-bead胰蛋白酶消化制备质谱样品。LC-MS/MS分析在Orbitrap Tribrid Lumos质谱仪上进行，分别采用DDA和DIA模式。DDA数据使用Peaks Studio 11进行分析，DIA数据使用DIA-NN软件进行处理。定量分析和数据可视化使用Python和R进行。所有Co-IP/MS实验均设置了重复，质谱蛋白质组学数据已存入ProteomeXchange Consortium。
