《Plants》：Modeling the Effect of Cold Stratification on Seed Germination Performance of Rudbeckia fulgida Aiton Using Response Surface Methodology (RSM)
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本研究采用响应曲面法（RSM）精细建模，揭示了Rudbeckia fulgida种子萌发对冷层积时长（0–165天）的高度依赖性。结果表明，延长层积时间可显著提升萌发率（最高达96.7%），且温度与种子重量变化亦为关键调控因子。RSM模型预测精度高达99%，为物种保育、园艺生产及生态修复提供了可靠的量化方案。
研究背景与目的
种子萌发是从胚胎静止状态向自养生长过渡的关键阶段，其时间安排对植物生存、适应性和种群长期存续具有决定性作用。在温带生态系统中，萌发时间受到种子休眠的严格控制，这是一种适应性性状，使种子能够延迟萌发，直到环境条件达到最优。本研究聚焦Rudbeckia fulgida Aiton（菊科）种子的生理休眠现象，该物种具有重要的生态、园艺和生物医学价值，但其种子萌发常因休眠而受阻。先前研究表明，冷层积是打破该属物种休眠的有效方法，但关于R. fulgida的最佳层积时长及其萌发响应的定量模型仍缺乏系统研究。本研究旨在通过高分辨率实验设计（0-165天，15天间隔）和响应曲面法（RSM），精确量化冷层积持续时间对R. fulgida种子萌发性能的影响，并建立高精度的预测模型。
材料与方法
实验材料为从土耳其里泽雷杰普·塔伊普·埃尔多安大学Zihni Derin校区采集的成熟R. fulgida种子。种子被分为11个处理组，分别对应0（对照）、15、30、45、60、75、90、105、120、135和165天的冷层积处理（4±0.5°C）。每个处理设6个重复，每个重复10粒种子。同时，设置一组在室温下保存的种子作为非层积对照。萌发实验在受控室温下进行，持续30天，以萌发百分比作为响应变量。测量了层积前后的种子重量变化以及萌发期的平均环境温度。采用非参数统计方法（Kruskal-Wallis检验、Spearman相关分析）比较组间差异和变量关联。关键创新点在于应用响应曲面法（RSM）构建二次多项式模型，以萌发百分比为因变量，层积时间（A）、温度（B）和重量差（C）为自变量，评估其主效应、二次项效应及交互作用。
结果
3.1 萌发成功率
不同冷层积持续时间对Rudbeckia fulgida种子的萌发百分比存在极显著影响（Kruskal-Wallis检验；H = 57.03, p < 0.001）。萌发率随层积时间延长而呈现清晰且一致的增长趋势。组A（0天）萌发率为0%，而组J（135天）和组K（165天）观察到最高平均萌发率（96.7%）。当层积时间达到或超过90天（G、H、I、J、K组）时，萌发率持续保持在较高水平（≥90%）。相比之下，未层积的种子（室温保存）在早期组（A2–G2）中几乎不萌发，仅在长期室温保存的组（H2–K2）中出现有限且不规则的萌发。
3.2 相关性分析
Spearman相关分析显示，在冷层积种子中，层积持续时间与萌发百分比呈极强的正相关（ρ = 0.914, p < 0.01）。环境温度也与萌发百分比呈强正相关（ρ = 0.894, p < 0.01）。层积持续时间与层积后种子重量也呈正相关（ρ = 0.419, p < 0.01）。在非层积种子中，储存时间与萌发百分比也显示出强正相关（ρ = 0.850, p < 0.01），但整体萌发水平很低，表明这种关联的生物意义有限。
3.3 非层积组的RSM发现
针对非层积系统建立的RSM模型，其确定系数（R2）和调整确定系数（Adj-R2）分别为85.04%和78.14%，模型整体显着性高（F = 12.32; p < 0.001）。温度因子对萌发具有主导效应（F = 19.68; p = 0.001），而层积时间（在此系统中恒为0）无显著影响。重量差的单独效应不显著，但其二次项（温度2）显着，表明温度对萌发存在非线性（曲线）影响。
3.4 层积组的RSM发现
针对层积系统建立的RSM模型表现出极高的预测准确性，R2 = 99.96%，Adj-R2 = 99.93%，Pred-R2 = 99.85%，模型整体极其显著（F = 2940.55; p < 0.001）。线性项的总贡献为92.01%，其中层积时间是主导因素。平方项的总贡献为6.59%，所有平方项（A2, B2, C2）均显着。交互作用项（A×B, A×C, B×C）的总贡献为1.37%，且均显着，表明各因素共同作用产生复杂的萌发响应。回归方程证实层积期是塑造萌发响应最强的因子。
讨论
本研究结果明确表明，Rudbeckia fulgida种子具有明显的生理休眠，需要足够长时间的冷层积才能解除休眠并成功萌发。萌发百分比随层积时间延长而单调强劲增加的模式，与低温在调节温带物种年度休眠循环中的基本作用一致。135-165天层积获得最高萌发率，表明该物种可能比菊科其他同类需要更长的冷处理时间。
萌发过程的成功涉及复杂的生理和分子机制。冷层积可能通过促进赤霉素（GA）生物合成、加速脱落酸（ABA）分解代谢、激活冷响应转录因子（如CBFs）来重新平衡内源激素。此外，层积还可能引发染色质重塑、表观遗传重编程以及细胞壁修饰等过程，为胚根突出做准备。种子重量在层积后的增加反映了吸水和代谢激活，是胚胎准备萌发的标志。
RSM模型的高精度表明，萌发是由层积持续时间、温度和种子重量变化构成的集成响应网络所控制，其中层积是解除休眠的主要触发因素，而温度和生理变化则调节萌发过程的效率和速度。两系统模型的对比（层积vs非层积）凸显了冷处理对打破R. fulgida休眠不可或缺的作用。
本研究通过高分辨率实验设计和RSM建模，首次为R. fulgida提供了量化的萌发优化方案。研究结果对该物种的园艺繁殖、生态恢复实践具有直接指导意义，也为理解气候变化（冬季变暖）可能影响其种群更新的潜在风险提供了生理学依据。
结论
本研究证实，冷层积对于解除Rudbeckia fulgida种子的生理休眠至关重要。萌发成功率与层积持续时间呈强正相关，135至165天的冷处理可实现最佳萌发效果（96.7%）。响应曲面法（RSM）成功构建了高精度预测模型（R2 = 99.96%），揭示了层积时间、温度和种子重量变化等因素之间复杂的线性、非线性和交互作用。该研究为R. fulgida的种苗生产提供了可靠的实践指南（推荐层积时间≥135天），同时也展示了一种量化分析种子萌发复杂生理响应的有效方法。
