综述：梭菌神经毒素研究进展：肠道屏障穿透与特定神经元靶向

《Toxins》：Advances in Clostridial Neurotoxins: Passage of the Intestinal Barrier and Targeting of Specific Neuronal Cells

本综述系统回顾了梭菌神经毒素（BoNTs/TeNT）穿透肠道屏障及靶向神经元机制的最新进展，重点阐述了毒素复合物结构（如L/HA和L/OrfX）在抵抗酸性环境与蛋白酶降解中的作用，以及其通过结合特定受体（如SV2、Syt、ganglioside）进入神经元并阻断神经递质释放（如SNAP-25、VAMP切割）的分子通路，为相关疾病（肉毒中毒、破伤风）的防治及毒素的临床应用提供了深入见解。

　　

梭菌神经毒素研究进展：肠道屏障穿透与特定神经元靶向

梭菌神经毒素，包括肉毒毒素（BoNTs）和破伤风毒素（TeNT），是已知最强大的毒素之一，分别导致严重的疾病——肉毒中毒和破伤风。它们的主要作用机制是阻断神经递质的释放。BoNTs在神经肌肉接头处阻止乙酰胆碱的释放，导致弛缓性麻痹；而TeNT在中枢神经系统的抑制性中间神经元中阻断甘氨酸和GABA（γ-氨基丁酸）的释放，引起痉挛性麻痹。这些毒素的高效力源于其多步骤活动机制的累积效应，包括穿透肠道和内皮屏障、靶向特定神经元以及与神经胞吐机制的关键组分相互作用。

结构特征与毒素复合物

根据免疫反应性，BoNTs被分为七种毒素型（BoNT/A至BoNT/G），每种型别又可进一步分为多种亚型。TeNT的多样性则较为有限。BoNTs和TeNT共享相似的结构，由一个约150 kDa的蛋白质前体经蛋白水解激活后，形成通过二硫键连接的重链（HC，约100 kDa）和轻链（LC，约50 kDa）。LC含有催化性锌结合基序（HExxH），是细胞内活性域。HC是负责运输和定位的模块，可进一步分为HCN和HCC两个主要结构域。HCN参与LC通过囊泡膜的易位过程，而HCC包含受体结合位点。

BoNTs与非毒性蛋白（ANTPS）通过非共价键结合，形成大小不同的肉毒毒素复合物（也称为前体毒素）。中等大小的复合物（M复合物）由BoNT和非毒性非血凝素组分（NTNH）组成。NTNH与BoNT结构相似，但在酸性pH下能形成紧密的互锁复合物，保护BoNT免受蛋白酶降解。M复合物在中性和碱性pH下会解离。大型复合物（L复合物）则由M复合物与血凝素组分（HAs）或OrfX/p47蛋白结合而成。L/HA复合物具有三叶草样折叠结构，其组装依赖于NTNH的nLoop区域插入HA70三聚体形成的中心孔。L/OrfX复合物包含OrfX1、OrfX2、OrfX3和P47蛋白，这些蛋白含有管状脂质结合（TULIP）样结构域，但其精确组装方式尚不完全清楚。

肉毒毒素穿透肠道屏障

肉毒中毒可通过多种途径获得，其中大多数自然感染病例的关键初始步骤是BoNT穿透肠道屏障。口服给药的致死剂量远高于注射途径，表明只有一小部分BoNT能通过肠道上皮转运。体外实验表明，BoNT单独作用时，可通过受体介导的转胞吞作用以极低的效率（<1%）穿越肠上皮细胞。GD1a/GD1b/GT1b等神经节苷脂似乎是BoNT/A和BoNT/B在肠上皮细胞上的主要受体。毒素通过非网格蛋白依赖的、由小GTP酶CDC42介导的途径进入细胞，并经由非酸化囊泡转运，从而将完整且完全活性的毒素递送至基底外侧。

L/HA复合物通过增加肠道通透性来增强BoNT的穿透。HA组分（如HA70和HA33）具有不同的碳水化合物结合特异性，能与肠道黏膜结合。完整的HA复合物能更强地结合肠道细胞微绒毛。此外，HA复合物还能与肠上皮细胞基底侧的E-钙粘蛋白结合，导致粘附连接和紧密连接的解体，从而为BoNT通过细胞旁路途径穿透屏障提供了便利。不同型别C. botulinum产生的HA复合物表现出不同的宿主特异性，这在一定程度上解释了肉毒中毒在不同物种中的流行情况。L/OrfX复合物中的OrfX/P47蛋白对BoNT/E的口服毒性至关重要，能显著增强毒素的肠道吸收，但其具体机制尚待阐明。

神经元细胞表面受体

梭菌神经毒素的一个标志性特征是其与特定神经元类型的特异性相互作用。双受体模型（包括神经节苷脂和膜蛋白）已被广泛接受。BoNTs优先结合GT1b、GD1b和GD1a，而TeNT结合GT1b、GD1b和GQ1b。BoNT受体的蛋白部分包括突触囊泡蛋白2（SV2s，被BoNT/A、E和F识别）和突触结合蛋白（Syt，被BoNT/B、DC和G识别）。SV2是一种跨膜转运蛋白，其大的腔内结构域（LD4）含有N-糖基化位点。Syt是一种锚定在突触囊泡膜上的蛋白，其触发Ca²⁺依赖的神经胞吐。

BoNT/A与SV2C-LD4的结合位点位于HCC_N和HCC_C亚结构域的界面处，并且识别SV2的糖基化（如Asn559糖链）对其高亲和力结合至关重要。BoNT/E则以不同的模式与SV2A-LD4相互作用。BoNT/B、DC和G的Syt结合口袋位于HCC_C结构域。Syt胞外域的结构转变（由GT1b结合诱导）对BoNT/B的高亲和力结合是必需的。最近的研究表明，BoNT/A进入神经元细胞需要神经节苷脂、SV2和Syt-I的协同作用，形成纳米簇，从而触发毒素的内吞。

神经元内活动与逆向运输

LC是锌依赖性金属蛋白酶。每种BoNT型和TeNT特异性地切割三种SNARE蛋白（VAMP、SNAP-25、syntaxin）之一，从而阻断神经胞吐机制。BoNT/A和BoNT/E都切割SNAP-25，但位点不同，导致其作用持续时间差异显著。BoNT/A切割产生的SNAP-25_1-197片段能作为显性负调控因子长效抑制神经胞吐，而BoNT/E切割产生的SNAP-25_1-180则不稳定。

TeNT进入运动神经元后，通过非酸化内吞囊泡进行逆向轴突运输，到达中枢神经系统的抑制性中间神经元。在此过程中，TeNT与细胞外基质中的巢蛋白（nidogen）结合，进而与神经元表面的LAR和PTPRδ受体相互作用，被分选到逆向运输途径中。进入抑制性中间神经元后，TeNT则依赖于神经节苷脂和SV2A/SV2B，通过酸化囊泡途径将其LC易位至胞质，切割VAMP。研究表明，BoNTs也能进行一定程度的逆向轴突运输，这可能与其某些治疗作用（如对运动障碍和疼痛的中枢调节作用）有关。

结论与展望

梭菌神经毒素的极端效力源于其多步骤活动机制的累积效应。对毒素复合物结构、肠道屏障穿透机制、神经元特异性受体识别以及细胞内运输和活动机制的深入了解，不仅有助于开发更有效的肉毒中毒和破伤风防治策略，也为设计用于特定临床应用（如延长作用时间、提高人源效力、靶向非神经元细胞等）的新型工程化毒素分子奠定了基础。这些毒素也是研究神经元膜受体组织和细胞内运输的宝贵工具。