Abstract
炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）的主要毒力因子包括胞外荚膜和两种二元毒素：致死毒素（LT，由致死因子LF和保护性抗原PA组成）和水肿毒素（ET，由水肿因子EF和保护性抗原PA组成）。在俄罗斯联邦，炭疽感染的流行病学形势依然严峻。在炭疽感染晚期，抗生素治疗失效，患者因血液中大量累积LT而在24小时内死亡。能够中和LT的抗体是这些患者的有效治疗手段。本研究旨在构建靶向LT保护性抗原的嵌合单克隆抗体，并阐明其中和毒素的机制。成功制备了靶向保护性抗原的嵌合单克隆抗体xi1E10。体外和体内实验均证明xi1E10能够中和致死毒素。共聚焦显微镜显示，xi1E10有效抑制功能性孔道形成，从而阻断致死因子向胞质溶胶的转运。这些结果表明，单克隆抗体xi1E10是开发治疗药物的有前景的候选者。
1. Introduction
炭疽是一种人畜共患传染病，由革兰氏阳性、需氧、产芽孢的杆状细菌炭疽芽孢杆菌引起。2024年，非洲、亚洲、北美、南美和欧洲多个国家报告了人类炭疽病例，非洲记录了大量感染。炭疽芽孢杆菌构成生物恐怖主义威胁，如2001年美国的攻击事件和欧洲的海洛因相关疫情。其基因组包含一个共价闭合染色体和两个毒力质粒pXO1和pXO2，分别编码免疫惰性荚膜和炭疽毒素。主要毒力因子包括胞外荚膜和两种二元毒素。炭疽毒素是一种三联A-B结构，具有酶活性A亚基——水肿因子（EF，89 kDa钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶）和致死因子（LF，90 kDa锌金属蛋白酶）以及受体结合/成孔B组分保护性抗原（PA，83 kDa前体）。PA与两个主要细胞表面受体结合：TEM8（ANTXR1）和CMG2（ANTXR2）。
735个氨基酸的保护性抗原（PA）包含四个结构域：结构域1（残基1–258）结合LF/EF；结构域2（259–487）通过形成阳离子选择性通道的柔性环促进PA63寡聚化和膜插入；结构域3（488–595）辅助寡聚化/LF-EF结合；结构域4（596–735）介导与受体的结合。PA83被弗林蛋白酶切割成PA63，使PA63前孔组装（七聚体/八聚体）。酸化触发结构域2重构，形成约2纳米孔道用于未折叠LF/EF的转运。
PA-LF/EF复合物通过网格蛋白依赖性内吞作用进入细胞，内体酸化诱导PA结构域2插入，形成真孔用于LF/EF转入胞质溶胶。LF切割MAPKK的N端序列，破坏免疫信号和巨噬细胞活力。在炭疽感染晚期，抗生素治疗无效，中和LT的抗体是有效治疗方法。
尽管已有raxibacumab（FDA 2012年批准）和obiltoxaximab（Anthim，FDA 2016年批准）等靶向PA的单抗，但仍存在局限性：无法穿透血脑屏障治疗脑膜炭疽，有超敏反应风险，需要冷藏和静脉给药。此前，团队开发了能有效中和LT的小鼠单克隆抗体，其中克隆1E10潜力最大，产生针对PA结构域IV的抗体。本研究目的是开发靶向炭疽保护性抗原的嵌合单克隆抗体并阐明其中和致死毒素的机制。
2. Results
2.1. Production and Characterization of Chimeric Monoclonal Antibodies to the Protective Antigen
以小鼠杂交瘤1E10为基础开发嵌合单克隆抗体。先前研究表征了mAb 1E10，证明其在体外试验和体内小鼠模型中具有强效中和炭疽致死毒素的能力。获得了表达xi1E10轻链和重链的DNA构建体，分别为质粒载体pSF-CMV-xi1E10_LC和pSF-CMV-xi1E10_HC。通过PCR扩增显示了小鼠mAb的cDNA片段和所得嵌合mAb的重组DNA链。
将质粒共转染至ExpiCHO-S细胞培养物中表达mAb xi1E10。通过亲和层析和凝胶过滤从培养上清液中纯化mAb xi1E10，从腹水中纯化mAb 1E10。每次腹水制备纯化抗体产量约5毫克。从1升培养物中纯化后获得约17毫克xi1E10。通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下评估经PNGase F处理的蛋白质产物的纯度。非还原条件下的全长mAb分析未发现二聚体或聚集物种，但检测到几个次要条带，很可能对应部分还原链间二硫键的抗体片段。还原的1E10和xi1E10样品均是纯的。
通过Western blot对靶抗原rPA和rPA IV进行定性评估，显示所研究mAb的活性。通过ELISA对系列稀释抗体与rPA IV抗原结合的半定量评估表明，两种抗体均以高亲和力结合抗原。免疫色谱分析将1E10鉴定为具有κ轻链的IgG1同种型。
通过表面等离子共振定量mAb 1E10和xi1E10与rPA IV相互作用的亲和力参数，得出平衡解离常数：Kd1E10 = 4.3 × 10?8M，Kdxi1E10 = 1.1 × 10?7M。
使用J774A.1细胞系通过MTT法分析体外毒素中和活性。通过测量固定毒素剂量下随着抗体浓度增加细胞 monolayer 存活率的增加来确定致死毒素中和作用。剂量依赖性中和分析表明，mAb 1E10在体外表现出更高的中和活性：其IC50为2.26 μg/mL，而mAb xi1E10的IC50为3.67 μg/mL。拟合比较具有统计学显著性（p < 0.001），相当于mAb 1E10约有1.6倍的效力优势。
随后在小鼠模型中评估了mAb的体内毒素中和活性。比较实验组小鼠的生存曲线，明显看出两种mAb在体内均表现出中和活性，并显著保护小鼠免于LT诱导的死亡。然而，用分析剂量的xi1E10和1E10治疗的小鼠之间生存率无统计学显著差异。
2.2. Study of the Mechanism of Neutralization of mAb xi1E10
本研究探讨了xi1E10中和致死毒素的潜在机制。由于该mAb是针对致死毒素PA的结构域IV获得的，在第一阶段研究中，使用共聚焦激光扫描显微镜评估了其对LT在小鼠巨噬细胞J774A.1中内化的影响。
未加mAb xi1E10的致死毒素在1.5小时后完全内化到细胞中，并定位于圆形区室；未检测到细胞表面的毒素。将炭疽LT与mAb xi1E10预孵育后，大部分毒素留在细胞表面，无法内化到细胞中。
然而，少量与xi1E10结合的LT确实进入了细胞。因此研究了LT随后的细胞内运输。鉴于PA在晚期内体膜上形成孔，确定了LT是否定位于晚期内体中。使用针对晚期内体受体Rab-7的抗体可视化晚期内体。观察表明，与mAb xi1E10预孵育后，LT不存在于晚期内体中；相反，毒素定位于缺乏Rab-7表达的独特环状中空囊泡。相比之下，未经抗体处理的LT在胞质溶胶中积累，未检测到其在晚期内体中的定位。
基于这些观察，提出假设：xi1E10促进致死毒素转运至溶酶体进行降解。为了研究这一点，用荧光染料Lysotracker Red DND 99染色溶酶体。FITC和Lysotracker Red DND 99荧光色素的共定位显示，毒素-xi1E10复合物定位于溶酶体中。Pearson相关系数为0.779，表明真正的共定位。这些数据证实，与mAb xi1E10预孵育后，LT定位于溶酶体。毒素-xi1E10复合物在溶酶体中积累，可能在那里经历蛋白水解降解，从而提供了mAb xi1E10的中和作用。
3. Discussion
单克隆抗体对LT在炭疽感染各阶段的治疗效力已被证实。大多数研究集中在获取针对炭疽芽孢杆菌PA的抗体，因为PA在炭疽发病机制中起关键作用。PA确保LT和OT进入细胞，因此抑制PA可保护细胞免受两种毒素的毒性作用。此外，PA与真核细胞表面受体（TEM8/ANTXR1, CMG2/ANTXR2）的结合是炭疽芽孢杆菌毒素多阶段细胞内渗透的第一个事件。
目前已有多种针对PA受体结合域IV的mAb：Raxibacumab、IQNPA、Obiltoxaximab ETI-204 (Anthim)、W1。其中只有Raxibacumab和Obiltoxaximab通过了所有临床试验阶段，并被FDA推荐与抗生素联合用于吸入性炭疽的治疗。其他抗体在动物中显示出良好的治疗效果。然而，开发和生产高效中和、人源化的抗LT mAb仍然是研究人员的紧迫任务。
此前，实验室开发了mAbs1E10，它特异性靶向炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）的结构域IV。该抗体在小鼠模型中表现出强大的保护效力。利用基因工程技术，通过将1E10抗体的小鼠可变区与人类恒定区组合，构建了嵌合抗体xi1E10。该设计旨在保留原始小鼠1E10的抗原特异性和中和能力，同时降低在人类中的免疫原性。
免疫色谱分析证实亲本小鼠mAb 1E10和嵌合xi1E10均属于具有κ轻链的IgG1同种型。对于基于单克隆抗体的毒素中和治疗剂，IgG1亚类是首选，因其具有有利的药代动力学特征和强大的功能特性，已获批准的针对肉毒杆菌和炭疽毒素的抗毒素就是证明。值得注意的是，IgG1对Fcγ受体（FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa）具有高亲和力，从而介导强大的效应功能，包括抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。这些效应机制通过招募免疫细胞来增强毒素中和，这一过程对于炭疽毒素至关重要，因为仅抗原结合是不够的。
评估了xi1E10的亲和力、其体外和体内毒素中和效力以及潜在的中和机制。两种mAb的比较分析显示，小鼠1E10在小鼠细胞系上表现出更优的亲和力和更强的体外中和活性。然而，在小鼠模型中，两种mAb的体内毒素中和效力无统计学显著差异。小鼠mAb 1E10对PA的更优亲和力表明其体内中和活性增强。然而，嵌合Mab中的人IgG1恒定区对小鼠新生儿Fc受体（FcRn）的亲和力显著高于小鼠IgG1，从而显著延长了嵌合xi1E10抗体相对于其亲本对应物的循环时间，这可能是mAb 1E10体内保护作用等效的主要原因。
最终，毒素中和单克隆抗体的治疗效力不仅受Fab区对毒素亲和力的影响，还受Fc区对FcRn亲和力的影响，FcRn调节抗体半衰期（T1/2）和系统暴露量，以血浆中浓度-时间曲线下面积（AUC）量化，反映总药物暴露量。嵌合mAb xi1E10在形成抗原-抗体复合物时也可能刺激宿主免疫反应。尽管可以在小鼠中评估其效应功能（ADCC, ADCP, CDC），但此类研究受到Fc受体和补体通路种间差异的限制。然而，毒素-抗体复合物通过吞噬作用激活、补体介导的调理作用和网状内皮系统Fc受体介导的摄取，被免疫系统更有效地清除。
为评估体外毒素中和活性，使用了巨噬细胞样细胞系J774A.1。选择该细胞系的理由是巨噬细胞在炭疽芽孢杆菌介导的发病机制中起关键作用。感染后，炭疽芽孢杆菌孢子被巨噬细胞吞噬并诱导TNF-α和IL-6产生；营养体形式的成分被巨噬细胞识别并刺激先天免疫反应。此外，研究FDA批准的抗炭疽毒素mAb（如Obiltoxaximab）体外效力的研究也使用了小鼠巨噬细胞系。
尽管选择了小鼠巨噬细胞系，但我们认为这些发现将有效地转化到人类细胞。Dekkers G.等人证明，人IgG亚类对小鼠Fcγ受体的相对亲和力与其对人类直系同源物的相对亲和力相当。值得注意的是，人IgG以 remarkably 高亲和力结合小鼠FcγRs——类似于小鼠IgG——并且很大程度上类似于人IgG结合人FcγRs，仅亲和力略有降低。这些观察表明，小鼠模型有效地再现了人IgG1的FcγR介导的效应功能。
单克隆抗体xi1E10与上述抗体类似，识别保护性抗原（PA）的结构域IV，由此提出假设：这些抗体抑制致死毒素（LT）内化到细胞中。在先前的研究中，分析了LT细胞毒性的潜在抑制步骤。出乎意料的是，单克隆抗体1E10不抑制以下过程：PA与J774A.1巨噬细胞样细胞系膜的相互作用；寡聚PA结构和前孔的形成；LF与PA之间的相互作用；以及在1E10抗体存在下LT的内吞作用。然而，1E10抗体抑制了LF对MEK1和MEK2的酶活性。基于这些发现，假设1E10单克隆抗体抑制LT的机制与破坏功能性孔道形成和LF无法转运到胞质溶胶有关。
共聚焦显微镜因其卓越的空间分辨率和在亚细胞水平生成高对比度三维图像的能力，是阐明单克隆抗体中和毒素机制的首选。该技术能够精确可视化毒素在细胞内的定位和运输，从而区分早期内体、晚期内体、溶酶体和胞质溶胶等不同细胞内区室。
在本研究中，使用共聚焦激光扫描显微镜进行了更详细的研究，发现单克隆抗体xi1E10抑制大部分LT内化到细胞中。进入细胞的少量与xi1E10结合的LT无法转运到胞质溶胶中，并在溶酶体中积累，在那里经历蛋白水解降解。总之，这些数据表明xi1E10通过部分抑制LT进入细胞并完全阻止真孔形成来中和LT细胞毒性，从而阻断致死因子（LF）向胞质溶胶的转运及其后续酶活性。
Raxibacumab和Obiltoxaximab中和炭疽毒素的机制是相似的。Raxibacumab与CMG2/TEM8细胞受体相互作用的分子动力学基于空间位阻：抗体的Fab片段占据PA的关键表位（受体结合区），阻止前孔寡聚体PA63的形成以及随后致死（LF）和水肿（EF）因子向胞质溶胶的转运。Raxibacumab结合不影响PA83 → PA63蛋白水解，但通过停止pH诱导的构象转变（内体中His121质子化）来阻断寡聚化和内吞作用，该转变是形成β孔所必需的。xi1E10抗体稳定PA的非活性构象，抑制pH依赖性蛋白水解成熟。因此，结构域II的β环无法释放并形成转运通道。LF被隔离在内体腔中，在那里经历溶酶体降解而非胞质溶胶释放，最终由于其MAPKK底物的N端水解而表现出无酶活性。
目前可用的靶向炭疽毒素的单克隆抗体存在若干局限性，包括疗效、特异性或可生产性不理想。因此，设计和生产针对这些毒素的新型高效mAb仍然是生物防御和治疗研究的紧迫优先事项。我们合成的mAb xi1E10为推进这一关键领域的研究提供了宝贵贡献。
4. Conclusions
成功获得了嵌合单克隆抗体xi1E10。体外和体内实验证实了其中和炭疽芽孢杆菌LT的能力。该mAb具有高亲和力特点，是进一步开发能够中和炭疽毒素药物的有前景候选者。单克隆抗体xi1E10的中和作用包括部分抑制致死毒素内化到细胞中并阻止在晚期内体中形成真孔。这促进了毒素在溶酶体中的完全降解并防止其释放到细胞胞质溶胶中。
5. Materials and Methods
5.1. Production and Purification of Recombinant Lethal Toxin Components
炭疽致死毒素的重组蛋白组分——全长保护性抗原（rPA）、致死因子（rLF）和PA结构域IV（rPA IV），均在原核系统中表达，每个都包含N端Myc表位和六组氨酸标签（6 × His）。
5.2. Generation and Purification of Monoclonal Antibodies Against Bacillus anthracis Protective Antigen
产生单克隆抗体1E10的杂交瘤在小鼠体内作为腹水生长。小鼠杂交瘤于2019年9月2日保藏于国家病原微生物保藏中心（俄罗斯莫斯科州奥博连斯克），保藏号H-89。通过使用Protein G Sepharose的亲和层析从腹水中分离小鼠抗体，随后在Superdex 200柱上进行额外纯化。
从1E10杂交瘤细胞中提取总RNA，然后使用RevertAid RT Kit进行逆转录。通过5'-RACE法测定编码mAb 1E10可变区的序列，使用引物对MOCG12FOR/XSCTnTag和CKMOsp/XSCTnTag分别扩增Fd（VH + CH1）和LC（VK + CK）区域。将PCR产物克隆到pUC19质粒中。对所得质粒进行测序以确定VH和VK编码序列。然后通过PCR扩增这些区域，使用的引物在5'端引入NcoI限制性位点和H5/L1信号肽DNA，在3'端引入BseRI位点以便与恒定区DNA无缝融合。将所得产物克隆到质粒载体pSF-CMV-HuIgG1_HC（OG527）和pSF-CMV-HuKappa_LC（OG528）中，以生成用于xi1E10表达的重链和轻链质粒：pSF-CMV-xi1E10_HC和pSF-CMV-xi1E10_LC。在ExpiCHO-S细胞中通过以1:2比例共转染HC/LC质粒产生重组xi1E10。按照ExpiCHO Expression System Kit用户指南中的"Max Titer Protocol"进行预培养、转染和表达。通过Protein A Sepharose亲和层析从细胞培养上清液中纯化嵌合抗体，随后使用Superdex 200进行尺寸排阻色谱。
通过ELISA评估纯化的小鼠和嵌合mAb对rPA IV的免疫学特异性。通过Western blot分析进一步验证了与rPA和rPA IV的抗原结合。
5.3. Determination of mAb Affinity Parameters
通过表面等离子共振（SPR）在Biacore X100仪器上测定抗体1E10和xi1E10与重组PA4d蛋白的平衡解离常数（K）。使用含HisTag分子捕获芯片。使用HBS-EP（10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Tween-20）pH 7.4作为工作缓冲液。将重组PA IVd蛋白作为配体以10 μg/mL浓度、10 μL/s流速上样60秒至芯片表面。分析物溶液（所研究的抗体1E10或xi1E10）使用浓度从800 nM到9.88 nM，以三倍滴定步进。分析物上样条件为：流速30 μL/s，上样时间120秒，解离时间600秒。使用350 mM EDTA pH 8.0溶液再生芯片表面30秒。使用Biacore X100 Evaluation Software v.2.0.2处理获得的传感图。使用平衡解离常数处理和计算传感图。
5.4. Toxin-Neutralizing Activity of mAbs In Vitro
使用J774A.1巨噬细胞系通过MTT试验评估毒素中和活性。将每孔2 × 104个细胞在90 μL生长培养基中接种到96孔板中，并在37°C、5% CO2下孵育过夜。
致死毒素（LT）组分的最终浓度为：rPA—0.5 μg/mL，rLF—0.1 μg/mL。测定中抗体浓度为0、2.5、5、10和20 μg/mL，对应于mAb:rPA摩尔比0:1、0.37:1、0.73:1、1.46:1和2.93:1。将LT和mAb在PBS缓冲液中预孵育1小时，然后将10 μL混合物加入细胞中。对照中，向旨在维持100%存活率的孔中加入10 μL PBS，而向指定为完全细胞死亡的孔中加入10 μL 0.25%硫柳汞。所有样品与细胞孵育4小时。孵育后，向所有孔中加入MTT溶液，随后在相同条件下孵育4小时。然后用DMSO溶解甲臜晶体，并在540 nm测量吸光度。实验进行三次。使用GraphPad Prism 6.00中的四参数逻辑非线性回归模型拟合剂量反应曲线。mAb浓度以对数刻度绘制。零抗体浓度下的响应（Bottom）约束为仅存在LT时细胞存活率对应的值。IC50值从拟合曲线中作为LogIC50参数的反对数获得。
5.5. Assessment of mAb Toxin-Neutralizing Activity in a Murine Model
实验中使用近交系BALB/c（H2d）小鼠。小鼠体重18–20克，6–8周龄，雌性。为确定提供致死毒素（LT）中和作用的保护剂量，BALB/c
