《SCIENCE ADVANCES》：Self-transforming hydrogel mimicking tertiary lymph nodes to activate cGAS-STING pathway for enhanced antitumor immunotherapy
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本研究针对传统三级淋巴结（TLS）诱导药物易引发自身免疫疾病及分布非特异性等问题，开发了一种基于壳聚糖的自转化水凝胶作为仿生TLS。该水凝胶在瘤周注射后快速原位凝胶化，通过吸附细菌病原相关分子模式（PAMPs）、肿瘤细胞损伤相关分子模式（DAMPs）及肿瘤相关抗原，高效招募并激活树突状细胞（DCs），经cGAS-STING通路促进细胞毒性T细胞（CTLs）生成，重塑免疫抑制微环境，显著抑制肿瘤生长与转移。该策略为安全可控的免疫治疗提供了新思路，发表于《SCIENCE ADVANCES》。
肿瘤免疫治疗旨在调动患者自身的免疫系统来精准攻击癌细胞，并建立长期免疫监视以防止复发。然而，肿瘤微环境往往表现出免疫抑制特性，如血管系统发育不良导致营养和氧气供应不足，代谢废物堆积，迫使免疫细胞与肿瘤细胞争夺养分，进而功能受损。此外，肿瘤细胞表达的免疫抑制分子（如PD-L1）会诱导T细胞耗竭，而肿瘤内特定细菌的存在甚至会加速肿瘤转移。这些因素共同导致免疫细胞浸润不足，使得原本可能对免疫治疗有响应的“热”肿瘤转变为“冷”肿瘤，疗效受限。
为了解决这些问题，研究人员将目光投向了一种特殊的结构——三级淋巴结（Tertiary Lymphoid Structures, TLS）。TLS是在非淋巴器官中病理条件下形成的异位淋巴结构，其功能和结构与次级淋巴结相似，能够为T细胞、B细胞等免疫细胞的激活提供有利环境。肿瘤内存在成熟的TLS通常预示着更好的治疗效果和预后。然而，TLS的自然形成过程缓慢，在小鼠模型中至少需要20周，且具有高度异质性，并非所有患者肿瘤内都能形成。传统的TLS诱导方法（如使用细胞因子、STING激动剂等）存在药物递送效率低、可能触发自身免疫疾病、以及TLS自身的血管系统可能参与肿瘤转移等风险。
因此，开发一种安全、可控、快速形成且有效的TLS模拟物，成为改善抗肿瘤免疫治疗的迫切需求。发表在《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）上的这项研究，创新性地提出利用一种自转化的壳聚糖水凝胶（COS）来模拟TLS的功能，从而在肿瘤局部激活强大的抗肿瘤免疫应答。
研究人员为开展本研究，主要应用了以下几项关键技术方法：材料制备与表征（包括水凝胶的合成、微观结构观察、力学性能测试）、体外细胞功能实验（如细菌/肿瘤细胞杀伤实验、树突状细胞成熟与迁移实验、蛋白质印迹法分析信号通路）、小鼠皮下移植瘤模型构建（使用BALB/c小鼠及4T1肿瘤细胞，并预先定植大肠杆菌以模拟细菌感染的肿瘤微环境），以及深入的体内外免疫应答评估（包括流式细胞术分析免疫细胞亚群、免疫荧光染色、酶联免疫吸附试验检测细胞因子水平）。
制备和表征COS
研究首先通过溶胶-凝胶法制备了壳聚糖水凝胶。该水凝胶前体溶液在0°C时呈液态，具有良好的可注射性；在37°C下能在20分钟内快速凝胶化，形成稳定的水凝胶。扫描电子显微镜图像显示，水凝胶具有多孔结构，有利于细胞迁移和物质交换。力学测试表明其最大压缩载荷为4 N，足以在体内保持形状。体外稳定性实验显示，水凝胶在25°C或4°C下可保持结构完整性达6周。在小鼠皮下注射后，可观察到水凝胶结节的形成，且苏木精-伊红染色显示其能招募多种免疫细胞。
体外肿瘤/细菌杀伤及蛋白/DNA吸附能力
研究人员筛选出头孢噻肟作为对抗大肠杆菌的抗生素。体外实验证实，COS与头孢噻肟和多柔比星联用（COS-CTX-DOX）对大肠杆菌和4T1肿瘤细胞均表现出协同杀伤效果。更重要的是，水凝胶能通过静电相互作用有效吸附牛血清白蛋白、细菌和肿瘤细胞裂解物中的蛋白质成分以及小牛胸腺DNA。吸附的组分在水凝胶基质中分布均匀，且部分处于游离状态，便于免疫细胞摄取。
水凝胶系统对DC成熟和细胞迁移的作用
树突状细胞的充分激活是启动适应性免疫的关键。流式细胞术分析表明，吸附了细菌和肿瘤细胞裂解物的COS-CTX-DOX处理组，能最有效地促进DC2.4细胞的成熟（成熟率达24.6%）。蛋白质印迹法结果揭示，其机制与吸附的DNA激活cGAS-STING通路有关，表现为磷酸化的STING、TBK1和IRF3蛋白表达水平显著上调。此外，细胞迁移实验证明，植入水凝胶内的树突状细胞能够有效迁移出来，并保持良好的活性，这对于免疫细胞进入肿瘤组织行使功能至关重要。
体内形成水凝胶基仿生TLS
在携带4T1肿瘤（预先定植大肠杆菌）的小鼠模型中，瘤周注射水凝胶前体溶液可原位形成结节。免疫荧光染色显示，COS-CTX-DOX处理组形成的水凝胶结节内富含树突状细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等多种免疫细胞，Ki67染色表明这些细胞具有良好的增殖能力，类似于成熟的肿瘤相关TLS的结构和细胞组成。
COS-CTX-DOX的抗肿瘤免疫应答
流式细胞术分析进一步证实，COS-CTX-DOX组水凝胶结节内树突状细胞的成熟率高达50.7%，并能直接激活初始T细胞分化为产生干扰素-γ的细胞毒性T细胞。这些激活的免疫细胞随后迁移至肿瘤组织内，显著提高了肿瘤组织中的效应免疫细胞比例。血清细胞因子检测显示，促炎因子IL-6和TNF-α水平上升，而免疫抑制因子IL-10和TGF-β1水平下降，表明免疫抑制微环境得到有效重塑。
COS-CTX-DOX的体内抗肿瘤效果及生物相容性
体内治疗实验表明，COS-CTX-DOX联合治疗能有效清除瘤内细菌，并最显著地抑制皮下肿瘤的生长和肺转移。小鼠体重监测和主要器官H&E染色未发现明显毒性，血液生化指标也在正常范围内，证明了该治疗策略的良好安全性。
体内COS的降解及其长期安全性
水凝胶在皮下植入小鼠后，可在7周内完全降解，无需手术取出。长期观察显示，植入水凝胶虽会暂时升高血清IL-6和TNF-α水平，但主要器官未出现病理性损伤，表明其具有良好的生物相容性和长期安全性。
综上所述，本研究成功开发了一种基于壳聚糖的自转化水凝胶作为仿生三级淋巴结。该水凝胶能够局部富集肿瘤细胞和细菌被杀伤后释放的危险信号（DAMPs和PAMPs），高效招募并激活树突状细胞，通过cGAS-STING通路启动强烈的T细胞免疫应答，进而有效逆转肿瘤免疫抑制微环境，抑制肿瘤进展。与天然TLS或传统诱导方法相比，这种仿生TLS具有形成快速、位置可控、无需额外免疫刺激剂、且无血管系统介导转移风险的独特优势。该研究为革新当前基于TLS的免疫治疗策略提供了全新的视角和极具潜力的平台技术，有望为临床肿瘤免疫治疗带来新的突破。
