《Horticulturae》：Research on the Response Mechanism of the Photosynthetic System of Panax ginseng Leaves to High-Temperature Stress
编辑推荐：
本研究通过整合生理学、转录组学、激素分析与功能遗传学手段，揭示了葫芦砧木增强甜瓜接穗生长的分子机制。研究证实砧木特异性诱导接穗顶端663个核心差异表达基因（DEGs），并显著富集于碳水化合物代谢与植物激素信号转导通路。激素检测显示接穗中细胞分裂素（CTK）和乙烯（ETH）水平特异性升高，伴随关键基因MELO3C016881 (LOG) 和 MELO3C007769 (ERF060) 上调。病毒诱导的基因沉默（VIGS）验证二者是砧木赋予生长优势的必要因子，为砧穗互作调控作物生长提供了关键分子靶点。
1. 引言
嫁接是一项古老的园艺技术，已成为现代园艺的基石，尤其对于葫芦科和茄科等高价值蔬菜作物。通过将强壮的根系（砧木）与选定的地上部品种（接穗）结合，嫁接提供了一种有效的非转基因策略，以增强作物对土传病原体及非生物胁迫的耐受性。除了抗逆性，嫁接的主要农艺动机是利用砧木介导的生长活力，即强壮的砧木能显著增强接穗的生长、生物量积累和产量均匀性。
甜瓜是一种重要的经济作物，但其栽培常受土传病害敏感性和环境胁迫的限制。使用葫芦等砧木进行异源嫁接已成为克服这些限制的常见实践。葫芦砧木以其与甜瓜的良好兼容性及促进接穗旺盛生长的能力而闻名。虽然嫁接的表型益处已明确，但驱动这种嫁接诱导活力的分子机制，特别是将砧木影响转化为接穗生长增强的关键遗传调控因子，仍不清楚。
砧木诱导的生长性能改善是一个复杂性状，可能由系统性信号协调，这些信号调控接穗的转录组、植物激素谱和代谢流。然而，许多研究缺乏严格的实验设计来区分一般的创伤或嫁接相关反应与砧木特异性反应。因此，接穗内直接负责将砧木来源信号转化为持续生长活力的核心遗传调控因子及其运作的关键信号通路仍未被确定。这一基本空白阻碍了对砧穗通讯的机制理解，并限制了针对性育种策略的发展。
2. 材料与方法
2.1. 植物材料与生长条件
研究使用葫芦‘浙蒲6号’（ZP6）作为砧木，甜瓜‘Védrantais’（Ved）作为接穗。种子经温水和去壳处理后，在黑暗、28°C下发芽。为同步发育阶段，砧木种子比接穗早播种3天。所有植株在受控温室中培养。
2.2. 嫁接方法
采用插接法进行嫁接。设立三个实验组：异源嫁接（CM/LS，Ved接穗/ZP6砧木）、同源嫁接（CM/CM，Ved接穗/Ved砧木）和未嫁接对照（CM，自根Ved幼苗）。嫁接后植株在人工气候室中管理，以促进愈合。
2.3. 植株生长测量
嫁接后24天进行表型评估。测量参数包括接穗鲜重、株高和茎粗。
2.4. RNA测序与实时荧光定量PCR分析
采集接穗顶端组织进行RNA提取、建库和Illumina测序。基因表达水平以FPKM值量化。通过RT-qPCR验证RNA-seq数据的准确性。
2.5. 植物激素的HPLC定量
使用超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）定量分析接穗顶端组织中的生长素（AUX）、细胞分裂素（CTK）、乙烯（ETH）、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）水平。
2.6. VIGS测定与表型观察
采用烟草脆裂病毒（TRSV）为基础的VIGS系统，对候选基因MELO3C016881 (CmCTK) 和 MELO3C007769 (CmETH) 进行功能验证。通过农杆菌介导的真空渗透法侵染甜瓜子叶，观察沉默后的表型变化。
2.7. 统计分析
所有表型和激素数据以均值±标准差表示。使用Student's t检验和单因素ANOVA评估统计学显著性。
3. 结果
3.1. 葫芦砧木增强甜瓜接穗的生长
与同源嫁接和自根对照相比，异源嫁接到葫芦砧木上的接穗表现出显著增强的生长活力。具体而言，接穗的株高、鲜重和茎粗均显著增加，而同源嫁接与自根对照之间无显著差异，表明嫁接操作本身不影响接穗生长。
3.2. 砧木诱导的甜瓜接穗转录组重编程
对接穗顶端组织的转录组分析显示，异源嫁接（CM/LS vs. CM）诱导了2290个差异表达基因（DEGs），而同源嫁接（CM/CM vs. CM）诱导了1627个DEGs。通过严格筛选，确定了663个核心DEGs，这些基因特异性地响应葫芦砧木的诱导。RT-qPCR验证证实了RNA-seq数据的可靠性。
3.3. 促生长基因的功能特征
对663个核心DEGs的基因本体论（GO）富集分析显示，它们在核糖核蛋白复合物生物合成、激素水平调控、RNA加工和核糖体生物合成等条目中显著富集。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析表明，这些基因显著富集于戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、甘油磷脂代谢、苯丙烷生物合成以及淀粉和蔗糖代谢等关键代谢通路。
3.4. 异源嫁接过程中激活的植物激素通路
植物激素定量分析显示，在异源嫁接接穗中，细胞分裂素（CTK）和乙烯（ETH）的水平特异性且一致地显著升高，而生长素、赤霉素和脱落酸的变化较小或不一致。转录组分析发现，CTK信号通路成分和乙烯响应转录因子（ERFs）等多个基因在异源嫁接接穗中显著上调。
3.5. 通过VIGS进行候选基因的功能验证
病毒诱导的基因沉默（VIGS）实验表明，沉默MELO3C016881 (CmCTK) 或 MELO3C007769 (CmETH) 均导致甜瓜植株生长显著受阻，鲜重显著降低，并特异性消除了砧木赋予的生长优势。RT-qPCR证实目标基因转录本水平显著降低。
4. 讨论
4.1. 转录与代谢重编程：活力的基础
葫芦砧木诱导了大规模的转录组变化。663个核心DEGs的鉴定精确指出了异源嫁接激活的遗传回路。这些基因在催化活性、代谢过程和碳水化合物代谢通路中的显著富集，表明砧木将接穗重编程至合成代谢增强的状态，为加速的细胞分裂和扩张提供支持。
4.2. 激素交互对话：整合生长信号
CTK和ETH作为观察到的活力的关键激素介质。活性CTK水平的显著增加，以及激活酶基因的上调，表明CTK信号传导的针对性增强。同时，乙烯响应转录因子的上调，包括经过功能验证的ERF060，指向了调节的乙烯响应。CTK和ETH之间的交互对话已知能微调生长过程，VIGS验证证明这两个通路的并发活性对于本系统中的活力表型在功能上是必需的。
4.3. 砧木-接穗通讯的前瞻性机制
砧木引发接穗重编程的起始信号需进一步研究。接穗自身CTK和ETH生物合成及信号通路基因的特异性上调表明，葫芦砧木的影响超出了简单的激素供应，可能涉及对接穗自身遗传程序的调控。这种长距离调控的机制可能涉及来自砧木的可移动分子，例如移动RNA。
4.4. 局限性与未来展望
本研究聚焦于单一砧穗组合在苗期的情况。未来的重要方向是测试其他具有不同活力潜力的砧木基因型，以确定已鉴定的核心DEGs和CTK-ETH交互对话是否代表保守机制。此外，对663个核心集合中其他基因的功能表征将提供更完整的机制图景。
5. 结论
本研究证明葫芦砧木通过协调的转录和激素重编程增强甜瓜接穗生长。这种活力是由核心碳水化合物代谢通路上调与协同的细胞分裂素-乙烯交互对话共同驱动的。关键调控基因，包括LOG (MELO3C016881) 和 ERF060 (MELO3C007769)，被功能验证为这一过程的重要介质。这些发现阐明了砧木诱导活力的核心分子框架，并为旨在开发更具韧性和生产力的嫁接作物的育种和生物技术方法提供了具体的遗传靶点。
