《Horticulturae》：Functional Identification of the RiPFK2 Gene in Raspberry (Rubus idaeus L.) Demonstrates That It Enhances Fructose Content Inside Fruits
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本研究首次在树莓中鉴定出RiPFK2基因，通过转基因番茄和瞬时转化树莓实验证实其过表达可显著提升果实果糖含量。该基因通过调控糖代谢关键酶（PFK、NI、FRK等）活性及转录因子（bHLH025/095）表达，协同促进蔗糖-己糖转化途径，为高甜度树莓品种育种提供新靶点。
果实甜度形成机制与RiPFK2基因的发现
果实甜度是鲜食树莓品质的核心指标，主要由可溶性糖和有机酸含量调控。树莓成熟过程中果糖占比高达40-50%，但其积累的分子机制尚未系统阐明。本研究以树莓品种‘Caroline’为材料，通过检测果实发育期糖含量变化结合转录组分析，发现差异表达基因RiPFK2在果实糖分快速积累期显著上调。
糖代谢通路的关键调控节点
可溶性糖作为光合产物在果实中的积累受糖代谢通路精密调控。磷酸果糖激酶（PFK）催化果糖-6-磷酸转化为果糖-1,6-二磷酸，是糖酵解途径的关键限速步骤。研究显示，PFK家族基因在柑橘、荔枝、苹果等果实成熟期均存在上调表达，且与可溶性糖积累正相关。树莓转录组数据中，糖代谢相关通路（如糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢）显著富集，其中7个PFK基因中有5个在果实发育期持续上调。
RiPFK2基因的结构与表达特性
RiPFK2编码序列长870 bp，编码264个氨基酸的亲水性蛋白，二级结构以α-螺旋（39.77%）和无规则卷曲（35.61%）为主。系统进化分析表明其与扁桃PFK2（PaPFK2）亲缘最近。亚细胞定位实验证实RiPFK2定位于细胞质，qRT-PCR显示其在成熟期果实中表达量最高，与果糖积累趋势一致。
功能验证：转基因番茄模型中的糖代谢重塑
构建35S::RiPFK2-GFP过表达载体转化番茄‘MicroTom’，发现转基因株系果实中PFK酶活性显著提升。成熟期（50天）果糖含量达野生型的1.44倍，葡萄糖和蔗糖同步增加。中性转化酶（NI）活性在后期快速上升，而果糖激酶（FRK）、己糖激酶（HXK）活性随成熟度下降。相关基因表达分析显示，SlNI、SlSPS2及转录因子SlbHLH025/095的表达趋势与酶活性变化耦合，表明RiPFK2通过调控糖代谢网络多节点协同促进糖分积累。
瞬时转化树莓果实的佐证
通过真空浸渍法瞬时过表达RiPFK2于树莓红熟期果实，3天后果糖、葡萄糖、蔗糖含量分别为对照的1.45倍、1.40倍和1.19倍。果实出现皱缩但未腐烂，证实RiPFK2对糖积累的直接促进作用。该结果与转基因番茄实验相互印证，凸显RiPFK2在跨物种中的功能保守性。
讨论：糖代谢网络的协同调控机制
研究提出RiPFK2可能通过双重路径调控糖代谢：一是直接催化果糖-6-磷酸进入糖酵解，减少蔗糖合成底物；二是通过hexose-P信号反馈调节NI、SPS等关键酶基因表达。bHLH转录因子的上调提示其可能参与糖代谢转录重编程，这与苹果MdbHLH033、草莓FabHLH09的调控功能相似。值得注意的是，转基因果实中蔗糖含量增幅低于己糖，可能与PFP（焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶）的代偿作用有关。
结论与应用前景
RiPFK2作为胞质定位的PFK家族成员，通过增强糖代谢通量及调控相关转录因子，显著提升果实果糖占比。该基因为树莓风味改良提供了关键靶点，也为蔷薇科果树糖代谢育种策略设计奠定理论基础。
