生物刺激素（Kiana Earth?与Kiana Climate?）对生菜生长及营养品质的协同增效机制研究

《Horticulturae》：Biostimulants Enhance the Growth and Nutritional Quality of Lettuce (Lactuca sativa L.)

本综述系统评价了两种商用生物刺激素（Kiana Earth?与Kiana Climate?）对生菜（Lactuca sativa L.）生长、产量及营养品质的调控作用。研究表明，生物刺激素与化肥配施（如T6、T7处理）可显著提升植株形态指标（株径、茎粗）、生物量、叶绿素含量及抗氧化物质（维生素C、总酚、黄酮），同时优化氮素同化效率（降低叶片NO3?积累），并促进微量/常量元素吸收与土壤有机质（OM）提升，为可持续农业提供有效策略。

　　

摘要

生物刺激素已成为提高作物生产力和品质的有效工具。本研究评估了两种商用生物刺激素产品（Kiana Earth^?和Kiana Climate^?）对生菜生长、产量和品质的影响。设立了八个处理，包括六种不同的生物刺激素配方、一个空白对照（不施肥）和一个阳性对照（施用化肥）。生物刺激素处理显著改善了植株和茎直径、鲜重和干生物量以及产量。最佳产量和形态表现来自T6（Kiana Climate^?+ 75:50:75 kg ha^?1N:P:K）和T7（Kiana Earth^?+ 150:100:150 kg ha^?1N:P:K）处理，这些处理结合了生物刺激素和肥料。叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素水平在生物刺激素处理下显著更高，表明生物刺激素增强了光合效率。生化分析进一步发现维生素C水平、总抗氧化能力、总酚类化合物和类黄酮含量显著增加，尤其是在T5至T8处理中。氮同化分析显示，与单独使用化肥相比，联合处理的叶片NO₃^?水平较低，表明生物刺激素提高了氮利用效率。微量营养素（Fe、Zn、Cu、Mn、Na）和常量营养素（N、P、K、Ca、Mg、S）水平在富含生物刺激素的处理中显著增加，同时土壤有机质也有所提高。生物刺激素，特别是与矿物肥料结合使用时，显著增强了生菜的生长、产量和营养品质，同时促进了土壤肥力。这些发现凸显了生物刺激素作为传统、再生和有机农业实践中有价值工具的潜力，为在确保长期土壤肥力的同时提高农业生产力提供了一种可持续的方法。

1. 引言

可持续粮食生产和农业实践与全球未来福祉密切相关。健康的植物和土壤是高效可持续农业的基础。然而，随着气候变化的开始，干旱和洪水等极端事件的频率增加，这降低了作物产量并对农民收入产生负面影响。土壤健康和生产力依赖于土壤生态系统的功能以及氮和碳循环的协调。然而，农业实践强度的增加降低了植物生产力，并导致土壤有机质净下降，从而过度依赖合成肥料。

过度使用矿物肥料和农药会导致土壤理化性质退化，破坏生物活性，并导致地下水枯竭和污染。这些做法增加了化学残留物在环境和农产品中积累的风险，对环境和人类健康构成重大威胁。因此，人们越来越有兴趣将可持续农业的“不伤害”原则扩展到恢复生态系统功能的再生方法。同时，不利的环境影响和不断上涨的肥料成本为采用替代或补充实践提供了动力。因此，鉴于土地退化和气候变化模式的挑战，生物刺激素在植物生产中的应用日益受到关注。

生物刺激素包括有机和无机来源的物质以及有益微生物。欧盟法规2019/1009将植物生物刺激素定义为一种刺激植物养分吸收的肥料，与植物养分含量无关。重要的是，其功能仅限于改善植物或其根际的一个或多个方面：养分利用效率、对非生物胁迫的耐受性、品质特征或土壤或根际中固定养分的可利用性。生物刺激素的例子包括氨基酸、藻类、氮化合物、腐殖酸和富里酸、壳聚糖和几丁质样聚合物、海藻和植物提取物、无机化合物以及有益细菌和真菌。它们被施用于植物、叶子、种子或根际环境以刺激植物生长，作为养分和土壤改良剂。其固有的分子多样性和复杂性有助于它们在可持续农业中的价值，促进潜在的协同效应。有机农业生物刺激素的混合物，例如海藻和腐殖质提取物，具有通过恢复自然土壤过程来增强再生农业的潜力，从而提高生产力。

腐殖质有助于调节植物和微生物生长、碳和氮循环、人为化合物和重金属的存在和移动以及土壤结构的稳定。胡敏素、胡敏酸和富里酸根据在不同pH水平下的溶解度进行区分。在低pH条件下，胡敏酸沉淀，而富里酸保持溶解。胡敏酸改善土壤结构并缓冲pH，从而增加土壤的持水能力和养分有效性，支持生长和产量，调节土壤生物区系，并选择性促进特定的根际细菌。在50%田间持水量的干旱胁迫下，施用基于腐殖质的生物刺激素于根部或叶片的生菜显示出改善的生长、光合作用和水分利用效率，同时活性氧（ROS）产生和脂质过氧化减少，与施用方式无关。富里酸通过加速细胞分裂、通过其對植物代谢的影响防止硝酸盐（NO₃^?）化合物积累、作为催化剂促进细胞内维生素运输以及增强植物对一系列生物和非生物胁迫的抵抗力来促进植物生长和发育。氨基酸是植物中必需的主要代谢物，影响细胞、组织和器官的各种理化性质。此外，它们有助于蛋白质和碳水化合物的合成，促进细胞分裂，并有助于天然生长激素的产生，最终导致产量增加和质量改善。氨基酸影响许多植物过程，例如毒素和重金属的解毒；养分的吸收、转运和代谢；维生素合成；以及对环境胁迫的耐受性。植物根际促生细菌（PGPR）与植物根系形成有益关系，鼓励生长和发育，同时提高植物耐受各种环境胁迫的能力。PGPR通过固氮、产生必需激素、改善水分和矿物质吸收以及加强根系生长来增强植物健康。最终，通过丰富根区的氮和促进关键营养素如钾（K）和磷（P）的矿化，这些细菌显著改善整体植物发育。一项关于番茄幼苗的研究表明，施用含有微生物（如固氮螺菌、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌）的生物刺激素优化了幼苗中的有机酸含量，从而提高了它们对干旱胁迫的抵抗力。在生菜中，生物刺激素的应用增加了植物生长和光合作用，同时改善了营养品质和抗氧化能力。较低剂量降低了叶片硝酸盐水平，而较高剂量增加了养分吸收（尤其是氮），从而减少了肥料需求。同样在生菜中，基于富里酸和海藻提取物的生物刺激素通常改善了生物量和养分吸收，并降低了叶片硝酸盐含量，而γ-聚谷氨酸（γ-PGA）尽管增加了根系生长，但对养分吸收的贡献有限。

生菜是全球广泛消费的绿色蔬菜，是纤维、铁和维生素C的重要来源。生菜植物依赖平衡的必需微量营养素和常量营养素供应以实现最佳生长。这些营养素的数量直接影响生菜作物的品质和产量，强调了提供平衡养分供应以确保高质量产品的必要性。虽然化学施肥在生菜种植中至关重要，但在收获前过度施用氮肥会导致叶片中NO₃^?的积累，对人类健康构成风险。

尽管研究已经证明了各种生物刺激素在生菜中的益处，但基于腐殖质、氨基酸、微生物、酶和藻类的配方在改善形态和关键生化品质参数方面的比较功效仍未得到充分解决。因此，本研究的目的是研究基于腐殖质、PGPR和氨基酸的生物刺激素配方对生菜的形态学（植株和茎直径、鲜重和干重）、生化（抗氧化能力、维生素C水平、叶绿素含量）和营养品质（植物营养元素、铵[NH₄⁺]、NO₃^?、土壤OM含量）的影响。

2. 材料与方法

2.1. 试验区域、植物材料和施用

本研究在2021-2022生长季于土耳其埃尔祖鲁姆阿塔图尔克大学园艺系试验区域进行。该地点海拔1900米，属于大陆性气候，冬季漫长寒冷，夏季凉爽干燥。土壤通常呈弱碱性（pH 7.825），有机质含量低（2.083%）。试验期间（4月至9月）2021年和2022年的气象数据包括总降雨量175毫米和186毫米，平均气温分别为19.3°C和18.7°C。该时期30年长期平均降雨量和温度分别为205毫米和17.5°C，表明试验季节接近正常。

研究所用植物材料为生菜品种Lactuca sativa var. crispa L. cv. Summer K?v?rc?k 010。该品种在土耳其温室和露地条件下广泛种植，尤其适应夏季，对养分管理和胁迫因素反应明显，是提高区域生产系统中养分利用效率和可持续性研究的相關且代表性選擇。种子播种在填充泥炭：珍珠岩混合物（2:1 v/v）的216孔穴盘中。约30天后，具2-3片真叶的幼苗被移栽至田间（两年均为5月25日），行距30厘米。试验采用完全随机设计（CRD），设三次重复，每重复10株，共八个处理。

试验包括八个处理组（T1–T8）——一个对照组（T1）、一个化肥组（T2；150 kg N ha^?1, 100 kg P₂O₅ha^?1, 150 kg K₂O ha^?1）和六个基于生物刺激素的处理组（T3–T8），指定如下：T3 = Kiana Earth, T4 = Kiana Climate, T5 = Kiana Earth + T2 (50%), T6 = Kiana Climate + T2 (50%), T7 = Kiana Earth + T2, T8 = Kiana Climate + T2。Kiana Earth通过滴灌方式施用于幼苗根际，每周一次，共三次。Kiana Climate在移栽后叶面喷施三次。两种生物刺激素的施用量均为10 kg/ha。研究在幼苗定植45天后结束，此时收获植物用于后续分析。

两种商用生物刺激素产品Kiana Earth^?和Kiana Climate^?用于促进土壤健康和改善植物对环境胁迫的耐受性。Kiana Earth^?含有腐殖质、氨基酸、有机酸、酶和有益微生物，施用于土壤，旨在提高土壤肥力、促进微生物活性和增加养分吸收效率。Kiana Climate^?含有有机酸、多酚化合物、氨基酸、酶、微生物、植物激素和天然矿物质，作为叶面喷施剂施用，其配方可通过改善植物生理弹性和促进生长与生产力来减轻极端温度的影响。该产品在大约-14°C至+55°C的温度范围内提供热保护，具体取决于施用频率。两种生物刺激素均按照制造商的建议使用。

2.2. 测量

本研究测量了若干形态、生理和生化特征，包括植株直径、茎直径、植株鲜重和干重、产量、叶片颜色值（L, a, b*）、叶绿素a和b含量以及总叶绿素。生菜产量也以g/m²为单位测定。用于测定总抗氧化能力、总酚和类黄酮含量的样品在分析前储存于-80°C。

2.2.1. 形态和产量指标测量

形态特征在幼苗定植45天后评估，以评价处理对营养生长的影响。从每个重复中小心拔出四株代表性植物并轻轻冲洗以去除土壤颗粒。记录以下属性：植株直径、茎直径以及植株鲜重和干重。植株直径使用数显卡尺在最外层叶尖最宽处两个垂直方向测量的平均值。茎直径在主茎基部、紧贴土表上方用数显卡尺测量。冲洗后记录植株鲜重。为测定干重，将植物样品在70°C烘箱中烘干至恒重（约48小时）后称重。产量通过称量每株生菜在收获时可上市的新鲜地上部分来确定。

2.2.2. 生理测量

使用色差计测量叶片颜色，随机选择两片叶子获取颜色值（L, a, b*）。为分析叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量，样品用80%丙酮溶液处理。使用Multiskan GO分光光度计测量过滤提取物在663 nm（叶绿素a）和645 nm（叶绿素b）的吸光度。然后使用Lichtenthaler和Wellburn提供的公式计算各自的含量。

2.2.3. 生化测量

维生素C含量以mg/100 g鲜重表示，使用抗坏血酸试剂盒定量；颜色强度使用Merc反射计测量。使用便携式叶绿素计测定生菜植株的叶绿素水平。

将每份样品5克与100 mL甲醇混合，在Stuart摇床中于室温黑暗条件下振荡过夜，并通过Whatman 1号滤纸过滤。然后将滤液与50 mL甲醇混合，振荡2小时，再次通过滤纸。在45°C旋转蒸发器中蒸发部分甲醇，将体积调整至50 mL。所得提取物用于测定总酚和类黄酮含量以及总抗氧化活性。

使用2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）测定法评估总抗氧化活性，该法测量抗氧化剂对稳定DPPH自由基的还原作用。制备DPPH自由基溶液，将39 mg自由基溶解于100 mL乙醇中。制备含有10、20、30和40 mg样品提取物的试管。向每管加入0.5 mL DPPH溶液，并用乙醇将最终体积调整至3 mL。涡旋混合后，将混合物置于黑暗环境中30分钟。测量每个反应混合物在517 nm的吸光度以确定样品提取物清除DPPH自由基的能力。基于这些吸光度读数计算IC50值。

将0.1 mL各制备好的提取物与Folin-Ciocalteu试剂和Na₂CO₃在试管中混合，用蒸馏水将体积调整至10 mL。在室温下孵育1小时后，在760 nm测量吸光度。总酚含量以mg没食子酸当量（GAE）/100 g提取物表示，基于每日制备的没食子酸标准曲线。

为测定总类黄酮含量，首先将0.5 g各样品与2 mL蒸馏水混合，然后与0.15 mL 5% NaNO₂溶液混合。静置6分钟后，加入10% AlCl₃溶液（0.15 mL）。再静置6分钟后，向混合物中加入2 mL 4% NaOH溶液，并用蒸馏水将体积调整至5 mL。15分钟后，测量所得混合物在510 nm的吸光度。使用槲皮素和芦丁作为标准品。

2.2.4. NH₄⁺、NO₃^?、矿物质和土壤OM含量的测定

生菜叶片在68°C烘箱中干燥48小时，然后研磨。使用Vapodest 10快速凯氏定氮蒸馏装置通过凯氏定氮法测定总氮（N）含量。使用电感耦合等离子体发射光谱仪进行矿物质含量分析。为测定NO₃-N水平，测量在高酸性条件下水杨酸硝化形成的络合物在碱性溶液（pH > 12）中410 nm的吸光度。收获后土壤OM含量使用Smith-Weldon法测定。

2.3. 统计分析

试验采用完全随机设计，设三次重复，每重复10株。试验连续进行两年，由于年份效应和年份×处理交互作用不显著，数据合并进行汇总分析。从形态、生理和生化参数测定获得的所有数据均进行单向方差分析以确定处理效应的显著性。使用Tukey's Honestly Significant Difference (HSD)检验在p < 0.05概率水平评估处理均值间差异的显著性。为全面可视化所有测量变量中与处理相关的模式和累积响应，采用了多变量方法。使用组合数据集构建了极坐标热图。为便于处理的客观分组，在热图内进行了层次聚类分析（HCA）。使用Ward最小方差法进行聚类，欧几里得距离作为相异性度量。使用Minitab 22进行ANOVA和Tukey's HSD检验。使用OriginLab 2025生成图形可视化，包括极坐标热图。

3. 结果

3.1. 形态和产量相关参数

方差分析结果证实，所有形态和产量相关变量，即植株直径、茎直径、产量、植株鲜重和植株干重，均受施用处理的显著影响。生物刺激素的应用导致植株直径统计上显著增加。最大直径（29.00 cm，对照组[T1]为15.13 cm）记录于T5处理。同样，T6、T7和T8处理也产生显著大于对照处理的植株直径。茎直径随生物刺激素应用显著增加，从对照组（T1）的21.93 mm升至T8处理组的峰值37.47 mm。值得注意的是，T5、T6和T7处理也促进了茎直径的显著增加。这些值显著高于仅用化肥（T2: 25.47 mm）、仅用有机处理（T3: 28.60 mm）和仅用腐殖质/氨基酸处理（T4: 34.73 mm）获得的值。植株鲜重以对照处理最低，T7处理达到峰值，其次是T6。植株干重也在对照组最低，并随生物刺激素处理增加，在T5处理获得最高值，其次是T7和T6。此外，产量对生物刺激素应用反应积极。最低产量见于T1（对照）组，而最高产量见于T7组，显著超过所有其他处理记录的值。T6和T2处理也产生高产量，其次是T5和T8，T3和T4处理仅产生中等增产。

3.2. 叶片颜色特征和光合色素含量

方差分析结果表明，大多数颜色和叶绿素相关性状受处理显著影响，例外是颜色-L和颜色-b。叶片颜色参数受处理不同程度影响。对于明度（颜色-L）和黄蓝光谱（颜色-b），处理间未观察到统计学显著差异。相反，绿红光谱（颜色-a）受处理显著影响。最低的颜色-a值（反映最强烈的绿色）记录于T4和T3处理。最高的颜色-a*值（绿色最弱）见于T8处理，这也对应于最高的总叶绿素含量。

叶绿素含量受处理显著影响。叶绿素a含量随生物刺激素应用显著增加，在T8组达到最高水平，其次是T5和T7组，而最低值记录于对照组。将化学肥料与Kiana产品结合的处理（T5–T8）在叶绿素a积累方面显著优于对照和仅用化肥处理。叶绿素b水平呈现类似模式，最显著的值见于T4、T3和T8处理，最低见于T1处理。因此，总叶绿素含量在施用T8时最高，其次是T5和T3。这些数据表明，基于生物刺激素的处理相对于对照处理增强了色素生物合成和光合潜力。

3.3. 抗氧化化合物、酚类和类黄酮

方差分析结果显示，所有测量的生化和氮相关参数——维生素C含量、总抗氧化能力、总酚含量和总类黄酮——均受处理显著影响。维生素C水平在处理间差异显著。最低浓度见于对照组（T1），而最高浓度检测于T4组。T7和T5处理也产生明显高于对照处理的值。这些发现表明，生物刺激素的应用，特别是与化学肥料结合（T4–T7处理），促进了生菜叶片中抗坏血酸的积累。总抗氧化能力呈现类似趋势。最低值见于T1处理，而最高值记录于T8处理，其次是T3处理。在T6和T4处理下生长的植物也表现出比对照植物和单独使用化肥处理的植物显著更高的抗氧化潜力。

关于总酚含量，最高水平见于T6处理，其次是T7和T8。对照（T1）和仅用化肥处理（T2）的相应值分别为22.00和37.67 mg GAE/100 g FW。总类黄酮含量随生物刺激素处理显著增加。最低含量见于T1组，而最高含量见于T5组，其次是T4和T6组。

3.4. 氮同化

铵离子（NH₄⁺）水平在处理间差异很大。最高浓度（375.33 ppm FW）记录于T2处理，可能由于从化学肥料中吸收的氮增加。T6和T7处理也显示出相对于对照处理（T1）增加的NH₄⁺水平，尽管这些值与310.71 ppm FW的平均值无显著差异。对照处理（T1）产生最低的NH₄⁺浓度，268.33 ppm FW，表明在没有外部投入的情况下氮可用性或吸收受限。NO₃^?水平在处理间也差异很大。最高的NO₃^?含量见于T2处理，反映了所施肥料的高NO₃^?输入。T5和T6处理也导致高NO₃^?含量。相反，最低的NO₃^?水平发现于T1（对照）组。有趣的是，尽管一些生物刺激素组合（如T3、T4和T8）的应用仅导致NO₃^?水平中等增加，却实现了高产量和生物量，这可能归因于有机增强条件下更高的氮利用效率和加工。

3.5. 常量营养素积累

所有检测的常量营养素含量，包括N、P、K、钙（Ca）、镁（Mg）和硫（S），均受施用处理的显著影响。N含量（%）在仅用化肥处理组（T2）最高，在对照组（T1）最低。生物刺激素整合处理如T3、T4和T5导致中等偏高的N水平。有趣的是，T6–T8处理的N含量保持稳定（≈2.70%），表明在联合投入下N吸收一致。

与N动态平行，P含量（%）也对处理产生显著响应。最高值记录于T7处理，其次是T5和T2处理；最低的P积累见于T1处理。涉及Kiana生物刺激素的应用（T4–T8）通常导致改善的P营养，可能由于增强的根系活动和微生物促进的P溶解。

K含量（%）也在处理间显示显著