《Current Issues in Molecular Biology》：Exploration and Preliminary Investigation of Wiled Tinospora crispa: A Medicinal Plant with Promising Anti-Inflammatory and Antioxidant Properties
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本文推荐：本研究利用短串联靶标模拟（STTM）技术，在羊驼黑素细胞中有效敲低miR-5110表达，证实其通过靶向转录因子SOX10的3′-UTR上调其表达，进而激活小眼畸形相关转录因子（MITF）及其下游酪氨酸酶（TYR）、TYRP1、TYRP2等黑素生成关键基因的表达，最终促进总黑素、真黑素（eumelanin）和褐黑素（pheomelanin）的合成及TYR活性，为动物毛色调控提供了新的分子靶点和理论依据。
引言
黑素细胞是来源于神经嵴的特化细胞，分布于皮肤表皮基底层、毛囊球部、眼睛、耳朵和脑膜等部位。它们在皮肤先天免疫中扮演重要角色，并通过产生黑素来决定肤色。黑素合成发生在称为黑素体的细胞内细胞器中。黑素体是特化的、含色素的、与溶酶体相关的细胞器，能够合成两种类型的黑素颗粒：真黑素（棕黑色）和褐黑素（黄红色）。这两种黑素的含量和分布决定了动物皮肤和毛发的颜色。
羊驼，一种主要用于纤维生产的家养哺乳动物，拥有超过22种天然毛色，是研究黑素生成的理想模型。哺乳动物的毛色形成包括黑素细胞中黑素的产生以及黑素从黑素细胞向周围角质形成细胞的转移，这一过程由众多基因和微小RNA（miRNA）共同决定和调控。
微小RNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸（nt）的内源性非编码小RNA。它们通过与特定转录本的3′-非翻译区（3′-UTR）相互作用，导致翻译抑制和基因沉默，从而诱导靶序列的转录后沉默。许多miRNA调控着负责毛色的黑素生成过程。先前的研究表明，miR-5110通过共同靶向黑素亲和素（melanophilin）和WNT家族成员1（WNT1）来调控色素沉着。
短串联靶标模拟（STTM）技术利用靶标模拟（TM）原理，旨在抑制动物和植物中小RNA分子的功能。STTM是一种强大的技术，可补充现有的小RNA隔离方法。STTM长度约为100个核苷酸，包含两个miRNA结合元件（例如两个串联的TM），在miRNA切割位点有一个错配，并由一个48-88 nt的弱茎环连接子隔开。STTM部分通过小降解核酸酶的作用，诱导大多数（如果不是全部）同源miRNA的降解。
生物信息学分析揭示，性别决定区Y框蛋白10（SOX10）是miR-5110的另一个潜在靶基因。SOX10是一种重要的转录调节因子，在黑素细胞等多种细胞类型中发挥作用。因此，我们推测miR-5110的STTM（STTM-miR-5110）将通过靶向SOX10，抑制miR-5110在羊驼黑素细胞中上调黑素生成的作用。本研究旨在验证这一假设。
材料与方法
质粒构建
STTM-miR-5110如先前所述进行化学合成。通过将STTM-miR-5110插入双荧光素酶报告载体pmirGLO中，构建表达质粒pGL0-STTM-miR-5110。空载pGL0载体用作阴性对照（NC）。通过将羊驼SOX10的3′-UTR序列克隆到双荧光素酶pGL0载体中，构建荧光素酶报告质粒。使用包含SacI和XhoI限制性内切酶位点的引物，通过PCR从羊驼皮肤cDNA中扩增出含有miR-5110结合位点的羊驼SOX10部分序列。PCR产物和载体经SacI和XhoI消化后，连接产生pGL0-SOX10-wt（野生型，WT）构建体。使用位点定向基因突变试剂盒，根据制造商说明，突变这些质粒中的miR-5110结合位点，获得pGL0-SOX10-mut质粒。所有构建体均通过测序验证。
细胞培养与转染
将生长至77-80%汇合度的黑素细胞，按照制造商说明，使用Lipofectamine 2000分别转染pGL0-STTM-miR-5110和/或pGL0质粒。转染三天后，收集黑素细胞用于后续的定量实时PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blotting）分析。
双荧光素酶测定用于miRNA靶标验证
HEK 293T细胞系购自国家细胞库。HEK 293T细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。对于荧光素酶报告实验，将2 mg质粒共转染入HEK 293T细胞。使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测量荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活性通过海肾荧光素酶活性进行标准化，以考虑转染效率的差异。
定量实时PCR（qRT-PCR）检测miR-5110和mRNA
使用TRIzol试剂从黑素细胞中提取总RNA。对于mRNA的定量，使用TaKaRa Bio cDNA合成试剂盒将1 mg总RNA反转录成cDNA。对于miRNA的定量，使用cDNA合成试剂盒，以U6反向引物和通用引物生成cDNA。qRT-PCR分析在7500 Fast Real-Time PCR系统上进行，采用SYBR Green PCR Master Mix。引物序列列于表中。每个样品进行三次技术重复。miRNA和mRNA的表达水平分别相对于U6小核RNA和β-肌动蛋白（β-actin）mRNA进行标准化。使用比较Ct（2?ΔΔCt）方法评估miRNA和mRNA转录本的相对丰度。
蛋白质印迹分析
对于蛋白质印迹分析，从转染了pGL0-STTM-miR-5110和/或pGL0质粒的黑素细胞中提取蛋白质样品，进行8%或10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后将蛋白质电转移到PVDF膜上。膜用5%脱脂牛奶封闭2小时。随后，膜与适当稀释的一抗探针孵育，一抗针对SOX10、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2和β-actin，在4°C下孵育过夜。膜用TBST洗涤四次，每次5分钟，然后在37°C下与辣根过氧化物酶标记的兔抗IgG二抗孵育1小时。用TBST冲洗四次后，通过增强化学发光法检测抗原-抗体复合物。使用ChemiDOC XRS+成像系统成像后，使用Image-Pro Plus软件基于获得的免疫印迹图像进行蛋白质表达水平的定量分析。
免疫细胞化学
转染了pGL0-STTM-miR-5110或pGL0质粒的黑素细胞，用PBS洗涤三次，每次3分钟，并用4%多聚甲醛固定。随后，为了阻断内源性过氧化物酶活性，细胞在室温下于3%过氧化氢中孵育15分钟。用PBS洗涤后，细胞样品浸入BSA中，并在37°C下维持25分钟。最后，样品在4°C下于一抗（兔抗SOX10）溶液中孵育过夜。用PBS洗涤三次后，细胞与辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG在37°C下孵育30分钟，并通过显微镜观察。使用IgG作为针对NC的一抗。
黑素测量
转染了STTM-miR-5110或pGL0质粒的黑素细胞被收集并用PBS冲洗。为了测定总碱溶性黑素，将样品与1 mL 0.2 M NaOH混合，然后在475 nm波长下使用分光光度计记录吸光度。为了测定褐黑素，将样品溶解在磷酸盐缓冲液（pH 10.5）中，并在10,700× g下离心10分钟进行澄清，然后在400 nm波长下记录吸光度。为了测定真黑素，将样品在热的30%次磷酸和氢碘酸溶液中水解。冷却后，加入50%乙醇，样品在2234× g下离心10分钟。不溶性真黑素色素选择性地溶解在热氢氧化钠和过氧化氢中，溶液在10,700× g下离心1分钟进行澄清，然后在350 nm波长下记录吸光度。黑素含量相对于总细胞数进行标准化。每个实验包括三个生物学重复。
TYR活性测量
转染了STTM-miR-5110或pGL0质粒的黑素细胞用PBS洗涤三次，每次3分钟。随后，将细胞接种到96孔板中，每孔含有100 μL 1% Triton X-100，然后涡旋混合5分钟。在室温下孵育一小时后，向每孔中加入50 μL 1%左旋多巴（Levodopa），并将板在37°C下进一步孵育2小时。酪氨酸酶（TYR）活性通过分光光度法在460 nm波长下测量吸光度进行评估。
Fontana-Masson染色
转染了STTM-miR-5110或pGL0质粒的黑素细胞用PBS（pH 7.4）洗涤，并在4%甲醛中固定20分钟。通过将细胞与氨银溶液在55°C黑暗中孵育1小时进行细胞染色。随后，用蒸馏水多次洗涤染色的细胞以确保完全去除未结合的染色剂。然后，将细胞在含有0.2%氯化金和5%硫代硫酸钠的溶液中孵育2分钟，随后用核固红复染5分钟。每个染色步骤后，用蒸馏水洗涤，用中性树胶封片，并在光学显微镜下评估黑素。
统计分析
所有数据均使用T检验进行分析，正态性通过Shapiro-Wilk检验评估。该分析量化了靶miRNA和mRNA的表达水平、相应的蛋白质丰度、相对荧光素酶活性和细胞内黑素浓度，所有计算均使用GraphPad Prism（版本9.0）进行。数据报告为平均值±标准差（SD）。p < 0.05被认为具有统计学意义。
结果
STTM-miR-5110降低羊驼黑素细胞中miR-5110的水平
评估了转染STTM-miR-5110的黑素细胞中miR-5110的表达水平。与转染PGL0质粒的细胞相比，转染STTM-miR-5110的黑素细胞中miR-5110的表达显著降低（约38%，p < 0.05）。
STTM-miR-5110靶向SOX10
使用miRBase软件（版本22.0）进行的生物信息学分析显示，SOX10是miR-5110的潜在靶基因。为了确认STTM-miR-5110与SOX10的3′-UTR结合，我们构建了含有SOX10的WT或突变3′-UTR的质粒。与共转染pGL0和pGL0-SOX10的细胞相比，转染pGL0-STTM-miR-5110和pGL0-SOX10的细胞的荧光素酶活性增加了1.36倍（p < 0.05）。转染pGL0-STTM-miR-5110和pGL0-SOX10-mut的细胞的荧光素酶活性与共转染pGL0和pGL0-SOX10-mut的细胞的报告活性相似。这些数据表明，STTM-miR-5110通过靶向SOX10的3′-UTR显著增加了荧光素酶活性。
STTM-miR-5110过表达对SOX10 mRNA和蛋白质水平的影响
STTM-miR-5110的过表达导致SOX10 mRNA水平（2.2倍，p < 0.001）和SOX10蛋白质水平（1.3倍，p < 0.05）均增加，这通过qRT-PCR和蛋白质印迹分析证实。羊驼黑素细胞细胞质中SOX10表达的免疫组织化学分析显示，与共转染pGL0的细胞相比，转染pGL0-STTM-miR-5110的细胞的光密度增加了1.3倍（p < 0.01）。这些数据表明，SOX10通过STTM受到miR-5110的调控。
STTM-miR-5110过表达对黑素生成基因表达的影响
为了评估STTM-miR-5110在羊驼黑素细胞黑素生成中的功能作用，我们分析了与该通路相关的关键基因的转录活性。在羊驼黑素细胞中过表达STTM-miR-5110增加了黑素生成基因的mRNA表达，包括小眼畸形相关转录因子（2.0倍，p < 0.01）、酪氨酸酶（1.6倍，p < 0.01）、酪氨酸酶相关蛋白1（3.9倍，p < 0.001）和酪氨酸酶相关蛋白2（1.9倍，p < 0.01）。在羊驼黑素细胞中过表达STTM-miR-5110增加了黑素生成基因的蛋白质表达，包括小眼畸形相关转录因子（1.9倍，p < 0.05）、酪氨酸酶（1.3倍，p < 0.05）、酪氨酸酶相关蛋白1（1.8倍，p < 0.001）和酪氨酸酶相关蛋白2（1.6倍，p < 0.05）。
STTM-miR-5110过表达对黑素产生和TYR活性的影响
为了研究STTM-miR-5110在黑素产生中的功能，我们量化了过表达STTM-miR-5110的羊驼黑素细胞中总碱溶性黑素、真黑素和褐黑素的产生。结果表明，在羊驼黑素细胞中过表达pGL0-STTM-miR-5110使黑素产量增加约26%（p < 0.05），褐黑素产量增加约38%（p < 0.05），真黑素产量增加约56%（p < 0.001）。通过Fontana-Masson染色确认了黑素在过表达STTM-miR-5110的黑素细胞中的定位。过表达STTM-miR-5110的黑素细胞中黑素的含量和分布显著高于转染pGL0质粒的细胞。为了研究STTM-miR-5110是否影响TYR活性，我们测量了过表达STTM-miR-5110的羊驼黑素细胞的活性。结果表明，在羊驼黑素细胞中过表达pGL0-STTM-miR-5110使TYR活性增加了37%（p < 0.01）。
讨论
在动物模型中，位于内含子区域的STTM构建体有效抑制内源性miRNA活性，导致与miRNA靶基因3′-UTR融合的荧光素酶报告基因的去抑制。与这一机制一致，我们的荧光素酶报告实验证实miR-5110直接靶向SOX10的3′-UTR。此外，用STTM-miR-5110转染羊驼黑素细胞确实导致miR-5110水平的显著敲低，这为后续的表型和机制分析奠定了基础。
黑素细胞存在于皮肤、毛发和眼脉络膜中，负责合成黑素色素。这些特化细胞产生两种类型的黑素：真黑素（棕黑色）和褐黑素（黄红色）。在不同动物物种中，已鉴定出几种参与黑素生成调控的miRNA。在先前的研究中，我们发现miR-5110通过共同靶向MLPH和WNT1来调控色素沉着。在本研究中，我们鉴定了一个新的靶基因SOX10，并阐明了其下游通路。我们的核心发现是，通过STTM敲低miR-5110显著增加了羊驼黑素细胞中总黑素、褐黑素和真黑素的产生。
SRY HMG框（SOX）蛋白是属于HMG框DNA结合蛋白超家族的转录因子。这些蛋白质在发育过程中起关键作用。SOX10属于SOX-E组，该组还包括SOX8和SOX9。作为关键的转录调节因子，SOX10在包括啮齿类动物、斑马鱼、非洲爪蟾和人类在内的多种脊椎动物的神经嵴细胞形成中起着关键作用。SOX10在黑素细胞谱系的初始特化中起着关键作用，并且对迁移的神经嵴细胞的存活至关重要。在非洲爪蟾中的研究表明，SOX10在黑素细胞发育中起着关键作用，其靶向过表达直接促进黑素细胞群体的扩增。为了阐明黑素生成增加的机制，我们聚焦于SOX10-MITF轴。由于SOX10是miR-5110的直接靶标，预计在miR-5110敲低后其表达会被解除抑制。确实，我们的qRT-PCR和蛋白质印迹分析证实，与pGL0相比，STTM-miR-5110转染的细胞中SOX10 mRNA和蛋白质水平均显著上调。相应地，我们在实验中观察到MITF在转录和翻译水平上的表达同时增加。SOX10是MITF的关键转录调节因子。黑素细胞特异性转录因子MITF-M通过调节关键黑素生成酶（如酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）和多巴色素异构酶（DCT/TYRP2））的表达而发挥核心调节作用。与这一既定层级一致，黑素细胞中MITF的上调之后是TYR、TYRP1和DCT/TYRP2表达的显著诱导。酪氨酸酶是黑素合成中的关键酶，由位于小鼠7号染色体上的TYR基因编码。酪氨酸酶是负责黑素合成的限速酶。该酶介导L-二羟基苯丙氨酸（DOPA）氧化成DOPA醌。产生的醌是两种主要黑素形式：真黑素和褐黑素的共同生物合成前体。
此外，DCT/TYRP2是黑素细胞中SOX10的直接靶基因。先前研究表明DCT/TYRP2的表达受MITF转录因子控制。TYR是真黑素和褐黑素合成所必需的，而TYRP1和TYRP2对真黑素合成至关重要。正如预期的那样，STTM-miR-5110的过表达增加了真黑素和褐黑素的产生。
本研究中呈现的有希望的数据应在关键的方法学限制下进行解释：所有评估均在黑素细胞模型中进行，而非在目标物种羊驼中进行。这种实验设计反映了黑素细胞为STTM在黑素生成中的功能提供了一个标准化且可控的平台这一共识。此外，这种方法符合探索性研究的伦理框架，并且在推进到羊驼研究之前仍然在逻辑上可行。
未来的研究应致力于开发和使用羊驼模型，直接评估由STTM技术介导的miR-5110敲低是否能有效调节毛色表型。这将为其在生物学研究或动物生物技术中的潜在应用提供确凿证据，弥合细胞机制与生物体性状之间的差距。此外，考虑到生物安全，在将此结论外推到其他物种时，我们必须保持谨慎的态度。
结论
STTM-miR-5110是一种人工生物工具，通过降低miR-5110的表达来控制黑素生成。这一过程调节SOX10的水平，进而影响黑素细胞中黑素的分泌。
