FLT4基因c.3175G>C变异通过损害VEGFR3磷酸化导致原发性淋巴水肿的机制研究

《Current Issues in Molecular Biology》：Replication Stress in Cancer: Mechanistic Insights and Therapeutic Opportunities for Radiosensitization

本文聚焦原发性淋巴水肿的遗传基础，通过功能实验证实FLT4基因c.3175G>C（p.A1059P）变异损害VEGFR3（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3）的酪氨酸激酶活性，导致VEGFC（Vascular Endothelial Growth Factor C）依赖的受体磷酸化及表达上调受阻，为该变异致病性提供了关键证据，对罕见病精准诊疗具有重要价值。

　　

摘要

血管内皮生长因子受体3（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3, VEGFR3）在淋巴系统发育和结构维持中扮演关键角色。FLT4基因编码VEGFR3，其活性降低可导致淋巴系统发育不全或发育不良，引发原发性淋巴水肿。研究人员在原发性淋巴水肿患者中鉴定出FLT4基因的罕见杂合变异c.3175G>C（p.A1059P），初步证据提示其可能为致病性变异。本研究通过在细胞模型中过表达该变异，评估其功能影响。结果显示，与野生型相比，携带c.3175G>C变异的细胞其VEGFC依赖的VEGFR3磷酸化水平及FLT4表达均显著降低，证实了该变异在原发性淋巴水肿中的致病作用。

1. 引言

原发性淋巴水肿是一种罕见的遗传性疾病，发病率约为1/6000至1/10000，其特征是进行性水肿，具有表型和遗传异质性。先天性淋巴水肿在出生时或出生后不久出现，约影响1/6000儿童。迄今，已发现13个基因与原发性淋巴水肿相关，包括FLT4（VEGFR3）、GJC2、FOXC2等，其中多数基因编码的蛋白质参与VEGFC/VEGFR3信号通路。

VEGFR3是胚胎期淋巴管和血管系统发育及终生淋巴管结构维持的关键调节因子。FLT4基因包含30个外显子，编码一个1363个氨基酸的蛋白质，该蛋白含有七个免疫球蛋白样结构域、一个跨膜结构域和酪氨酸激酶结构域，是VEGFC和VEGFD的受体。FLT4的致病性变异与人类心血管疾病相关：免疫球蛋白样结构域的截断或移码突变与先天性心脏缺陷有关，而酪氨酸激酶结构域的致病性突变则与1A型原发性淋巴水肿（Milroy病）相关。

VEGFC与VEGFR3的结合是信号转导的关键事件，导致受体磷酸化并激活下游信号通路，影响淋巴管内皮细胞的增殖和迁移。酪氨酸激酶结构域的致病性突变可能损害ATP结合或抑制受体磷酸化，从而破坏淋巴系统发育。

尽管疾病机制较为明确，但评估单个遗传变异的临床意义仍具挑战。此前，在原发性淋巴水肿患者的FLT4基因序列分析中，发现了数个可能影响VEGFR3功能的罕见遗传变异，包括杂合变异c.3175G>C（p.A1059P）。基于患者临床特征、家族史和预测算法的初步评估提示该变异可能为致病性。本研究旨在通过功能实验，评估过表达c.3175G>C变异FLT4的模型细胞中VEGFR3的活性，以确认其致病性。

2. 材料与方法

2.1. 质粒制备

使用编码野生型FLT4基因序列的pHAGE-FLT4质粒进行转基因制备。采用定点突变技术，在pHAGE-FLT4质粒的第6622位点引入G>C替换，对应于FLT4 c.3175G>C变异。突变后质粒在大肠杆菌XL10-gold中扩增，并通过乙醇沉淀法提取质粒DNA。目标区域的核苷酸替换通过Sanger测序验证。

2.2. 引物设计

定点突变反应的引物通过QuickChange Primer Design工具设计。Sanger测序和定量PCR的引物则使用PrimerQuest工具设计。所有引物由Genterra JSC合成。

2.3. 慢病毒生产

采用磷酸钙法瞬时转染HEK293FT细胞生产慢病毒颗粒。使用的包装质粒为psPAX2，包膜质粒为pCMV-VSV-G。通过超速离心浓缩慢病毒，并在-86°C储存。病毒滴度通过荧光激活细胞分选术在HEK293FT细胞上测定。pHAGE-FLT4载体中，FLT4和EGFP基因由内部核糖体进入位点分隔，并共同受EF1A启动子调控，因此病毒滴度初步评估和细胞分选基于GFP荧光进行。

2.4. 细胞模型

通过慢病毒转导PC-3细胞，构建过表达野生型FLT4或c.3175G>C突变型FLT4的细胞系。转导时，向20万个PC-3细胞中加入10⁶转导单位的慢病毒和10 μg/mL硫酸鱼精蛋白。转导48小时后通过流式细胞术分析转导效率。在第6和第10代时，使用FACS Aria III分选GFP阳性细胞，目标纯度不低于90%。通过qPCR试剂盒测定每个细胞中整合的慢病毒拷贝数。细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。未转导的PC-3细胞作为对照。

2.5. VEGFR3通路激活

为分析短期VEGFR3通路激活，细胞在无血清培养基中饥饿处理16-18小时后，用100 ng/mL VEGFC在37°C刺激10、20或30分钟。刺激后，细胞用不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS洗涤，并在冰上用RIPA裂解缓冲液裂解。未处理细胞作为对照（0秒）。样品经10% SDS-PAGE分离后，转至PVDF膜，并用针对磷酸化VEGFR3、磷酸化AKT、总VEGFR3、总AKT及GAPDH的抗体进行检测。

2.6. 基因和蛋白表达分析

为评估VEGFC的长期效应，将细胞在含2% FBS和1000 ng/mL VEGFC的培养基中培养72小时。提取总RNA，使用RevertAid RT Kit合成cDNA。通过SYBR Green染料进行qPCR分析，以ACTB为内参，采用ΔΔCt法分析结果。蛋白质表达水平通过Western blot分析评估。

2.7. 统计分析

使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。采用单因素方差分析配合Tukey多重比较检验，或双因素方差分析配合Benjamini, Krieger and Yekutieli两阶段线性步升程序。数据以均值±标准误表示，并标注显著性水平。

3. 结果

3.1. 转基因制备和模型细胞生成

通过定点突变成功获得携带FLT4 c.3175G>C变异的pHAGE-FLT4质粒，Sanger测序验证了酪氨酸激酶结构域编码区的核苷酸替换。利用野生型和突变型质粒包装的慢病毒转导PC-3细胞。病毒滴度测定显示，野生型和c.3175G>C变异型慢病毒滴度相近。转导72小时后，野生型细胞的GFP阳性率为25.7 ± 1.1%，而突变型为12.0 ± 1.2%。经过两轮分选，GFP阳性细胞纯度达到90%以上。病毒拷贝数分析显示，对照细胞为0.03 ± 0.03，野生型细胞为6.12 ± 1.07，突变型细胞为4.24 ± 0.69，表明成功建立了稳定表达野生型和突变型FLT4的细胞系。

3.2. VEGFR3激活

3.2.1. VEGFC对VEGFR3通路活性和FLT4表达的促进作用在c.3175G>C变异细胞中减弱

qPCR结果显示，转导细胞的FLT4表达量比对照PC-3细胞高约70倍。用VEGFC处理72小时后，野生型细胞的FLT4表达从70.8 ± 1.0升高至404.7 ± 3.4，而c.3175G>C变异细胞仅从72.5 ± 1.0升高至216.0 ± 1.9，且突变型细胞在VEGFC处理后的表达水平显著低于野生型。Western blot结果进一步证实，在蛋白水平上，c.3175G>C细胞的VEGFR3表达量显著低于野生型细胞，并且VEGFC处理72小时并未显著增加突变型细胞的总VEGFR3水平。

3.2.2. FLT4 c.3175G>C变异无法在VEGFC刺激下快速激活

短期VEGFC刺激实验显示，在野生型细胞中，磷酸化VEGFR3水平在刺激10分钟时即升高，并在20和30分钟时保持稳定。然而，在c.3175G>C变异细胞中，从0到30分钟整个观察期间，仅检测到极低水平的磷酸化VEGFR3，且无明显变化。对AKT磷酸化水平的分析表明，在短期VEGFC处理下，两种细胞系均未观察到显著变化。

4. 讨论

VEGFR3的酪氨酸激酶结构域在物种和受体酪氨酸激酶家族中高度保守。第1059位的丙氨酸位于激活环内，其替换为脯氨酸可能改变活性位点的构象，多数生物信息学算法预测该替换具有破坏性。

c.3175G>C（p.A1059P）变异此前已在孤立性Milroy病患者中被报道，并被归类为“可能致病”。然而，缺乏功能实验证据难以准确评估其致病性。本研究通过过表达模型证实了该变异的致病作用。

研究发现，在表达c.3175G>C变异的细胞中，VEGFC对FLT4基因表达和VEGFR3蛋白表达的刺激作用均减弱。VEGFC/VEGFR3信号通路上调VEGFR3表达的机制尚未完全阐明，本研究表明c.3175G>C变异部分破坏了这一机制。在蛋白水平，受体水平对配体处理无反应，可能与翻译或翻译后修饰有关。研究观察到野生型VEGFR3的主要形式为125 kDa蛋白，而c.3175G>C变异体则以175 kDa形式为主，这与之前报道的其他FLT4致病突变（如P1114L和L1044P）的异常加工模式相似。

受体酪氨酸激酶的激活依赖于配体诱导的二聚化及随之发生的酪氨酸自磷酸化。本研究显示，c.3175G>C变异体的VEGFR3磷酸化水平极低且无法被VEGFC有效激活，表明其激酶功能严重受损。尽管分析了AKT磷酸化这一VEGFR3下游关键信号事件，但在短期刺激下未观察到变化，这可能与细胞模型或实验条件有关。

5. 结论

对于Milroy病等罕见病，多数新发现的遗传变异被归类为意义未明。人群分析和家系共分离分析常因样本量小、不完全外显等因素受限，数学预测算法结果也可能不一致。因此，利用模型系统进行功能分析为确认蛋白质功能障碍与疾病关联提供了最可靠的证据。

本研究使用PC-3肿瘤细胞来源的模型，证明了FLT4 c.3175G>C变异导致VEGFR3活性降低，支持其与原发性淋巴水肿发展的关联。突变变异的激活可能存在延迟，更长时间点的观察有助于阐明其激酶动力学参数。VEGFC对FLT4表达的刺激效应部分保留，这可能解释了该变异相关的不完全外显现象。此类功能研究为罕见遗传病的精准诊断和致病机制阐释提供了重要依据。