多平台代谢组学解码脑脊液：整合NMR与HPLC-MS的中枢神经系统代谢研究

《Methods and Protocols》：Decoding Cerebrospinal Fluid: Integrative Metabolomics Across Multiple Platforms

本综述系统介绍了脑脊液（CSF）的多平台代谢组学整合策略，结合质子核磁共振波谱（1H-NMR）与高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术，通过标准化样本采集、质量控制及冗余过滤流程，显著提升代谢物覆盖度与数据分析可靠性，为中枢神经系统（CNS）疾病生物标志物发现与代谢通路解析提供方法论支持。

　　

脑脊液的多平台代谢组学研究方法

摘要

脑脊液（CSF）作为反映中枢神经系统（CNS）生理与病理状态的关键生物基质，通过调节离子平衡、促进分子运输及清除代谢废物维持脑功能。本文提出一种标准化CSF采集流程，并结合整合性多平台代谢组学工作流，将质子核磁共振波谱（¹H-NMR）与高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术相结合。这种互补性分析策略可增强代谢物覆盖范围、提升分析稳健性，从而实现对CSF代谢组的全面可靠表征，为CNS相关疾病生物标志物发现及神经化学机制解析提供支持。

1. 1.
   引言
   脑脊液是位于脑室与蛛网膜下腔的无色透明液体，成人总量约150 mL，主要由脉络丛分泌。其循环受动脉搏动波驱动，并受呼吸、体位等因素调节。CSF不仅提供机械保护，还通过清除代谢废物、调节离子平衡参与脑稳态维持。代谢组学作为系统研究生物体内小分子代谢物的学科，能直接反映机体功能状态，较基因组学或蛋白质组学更贴近表型。目前多数研究仅采用单一分析平台（如NMR或LC-MS），而整合两者可弥补灵敏度与结构解析能力的不足。例如，Kim等（2023）通过¹H-NMR发现CSF代谢特征可用于原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）诊断，但预后价值有限；Locasale等（2012）则通过LC-MS/MS在胶质瘤患者CSF中识别出色氨酸衍生物及三羧酸循环成分等差异代谢物。本研究旨在建立一种整合¹H-NMR与HPLC-MS的大鼠CSF代谢组学工作流，结合瞬时血脑屏障开放（BBBO）模型，深入探索CNS代谢调控机制。
2. 2.
   实验设计
   CSF采集采用立体定位架固定麻醉大鼠，通过枕骨大孔穿刺抽取最大200 μL样本，离心后分装于-80°C保存。为满足多平台分析需求，每份样本分为三份：分别用于¹H-NMR、C18柱HPLC-MS及亲水相互作用色谱（HILIC）柱HPLC-MS分析。预处理阶段均加入甲醇沉淀蛋白质，并设置质控（QC）样本（每10个样本插入一次QC）监控技术误差。代谢物鉴定通过ASICS R包（NMR数据）和XCalibur软件（MS数据）完成，最终生成代谢物强度表格进行统计整合。
3. 3.
   实验流程
   3.1 CSF采集
   关键步骤需两人协作：一人操作注射器，另一人稳定翼状针。麻醉大鼠后固定于立体定位架，头部倾斜15°–20°暴露寰椎水平枕骨大孔，消毒后穿刺采集CSF。若出现红细胞污染需立即夹闭导管。样本离心后分装冻存。

3.2 预处理

样本按50 μL（两份MS用）和100 μL（一份NMR用）分装。

• •
  HPLC-MS分析：加入300 μL冷甲醇沉淀蛋白，离心取上清干燥后，分别用乙腈/水（9:1, HILIC）或甲醇/水（1:9, C18）复溶。
• •
  ¹H-NMR分析：样本与甲醇1:4稀释，离心后取上清干燥，复溶于含TSP（终浓度152 μM）的D₂O磷酸缓冲液。

3.3 分析流程

3.3.1 HPLC-MS

采用UPLC Ultimate WPS-3000系统，搭配C18柱（流动相：0.1%甲酸水/甲醇）或HILIC柱（流动相：10 mM甲酸铵水/乙腈），梯度洗脱28分钟（C18）或22分钟（HILIC）。质谱使用Q-Exactive Orbitrap，ESI正负离子模式扫描（m/z 58–870），分辨率70,000。进样体积5 μL（C18）或10 μL（HILIC）。

3.3.2 ¹H-NMR

使用Bruker DRX-600 Avance III HD谱仪，探头调谐至¹H频率，锁定D₂O溶剂信号后优化匀场。采集参数包含水抑制脉冲序列、90°脉冲及弛豫延迟，每个样本扫描64次。

3.4 数据处理

3.4.1 HPLC-MS

通过商业标准品库（610种代谢物）构建内参谱库，匹配规则包括保留时间偏差≤20秒、质量偏差≤10 ppm、信噪比≥3。峰面积积分后生成强度矩阵。

3.4.2 ¹H-NMR

原始FID信号经傅里叶变换、基线校正后，用ASICS包进行代谢物定量（最多190种）。以TSP为内标归一化。

3.4.3 质控与冗余过滤

计算QC样本中代谢物的变异系数（CV），剔除CV>30%的代谢物。对多平台重复检测的代谢物（如肌酸），保留CV最低的平台数据。最终矩阵添加KEGG标识符便于通路分析。

3.5 统计分析

3.5.1 冗余过滤与归一化

合并多平台数据后，以总离子强度归一化样本，剔除QC样本。

3.5.2 多变量分析

先进行主成分分析（PCA）探索离群值，再通过偏最小二乘判别分析（PLS-DA）筛选组间差异代谢物（VIP>1）。模型验证采用置换检验（p<0.05，Q2>0.5）。

3.5.3 单变量分析

使用Shapiro-Wilk检验正态性，非参数Dunn检验比较组间差异，Bonferroni校正p值（显著阈值<0.05）。计算Log₂FC并绘制火山图可视化。

3.5.4 生物学整合

通过超几何检验（KEGG数据库）进行通路富集分析，FDR校正后保留p<0.05通路。

1. 4.
   预期结果
   本研究以8只SD大鼠（4只对照，4只BBBO后3小时）为模型，成功采集CSF并完成多平台检测。NMR谱经ASICS重构后定量190种代谢物（图2）；HPLC-MS通过TIC（图3）及质谱扫描（图4）实现代谢物鉴定。冗余过滤后，约50%重复数据被剔除（表1）。例如肌酸在四平台均被检出，最终保留C18 ESI+数据（CV最低）（表2）。PCA显示BBBO组代谢离散度高于对照（图5），OPLS-DA模型（Q2Y=0.775）验证后识别出86个VIP>1代谢物，其中26个显著差异（表3）。通路分析显示精氨酸生物合成通路显著富集（p=4.44×10^?4，FDR=0.035）（表4），提示BBBO可能通过影响内皮细胞精氨酸代谢（如NO合成、尿素循环）扰动CNS稳态。本工作流侧重极性代谢物，未来可扩展至脂质组学。
2. 5.
   试剂配置
   磷酸缓冲液：用D₂O溶解K₂HPO₄与KH₂PO₄调至pH 7.4；TSP溶液：D₂O配制3.2 mM储备液。