《Seeds》：The Protective Role of Sodium Nitroprusside in Alleviating Salt Stress During Germination and Seedling Establishment of Thai Eggplant
1. 引言
在大多数农业区，气候变化和不稳定的天气模式已对植物生长和生产造成不利条件。在各种非生物胁迫中，土壤盐渍化是一个持久且重大的农业问题，既源于自然过程，也源于不可持续的人类活动。虽然盐渍化可以自然发生，但不合理的农业管理显著加速了其蔓延，导致土壤和地下水中可溶性盐分的积累。这一问题在沿海地区尤为严重，来自地下含水层等水源的灌溉水常受咸水入侵污染。最终，使用盐水灌溉结合不良的土壤排水是土地退化的主要驱动因素，导致表土盐分逐步累积。
盐胁迫通过限制水分吸收和诱导植物细胞内的离子毒性，严重影响植物生长和发育。这些影响在种子萌发和早期幼苗生长这一关键阶段尤为不利，这是许多蔬菜作物经常面临的挑战。茄子作为一种世界性的主要蔬菜作物，对土壤盐分中度敏感，盐胁迫会导致生理干旱、营养失衡以及盐分积累引起的离子毒性。
盐渍土壤通过诱导渗透胁迫（限制根系吸水）和离子毒性（由过量钠离子(Na+)和氯离子(Cl?)积累引起），为幼株创造了不利环境。这些复合胁迫干扰了重要的代谢和细胞功能，导致种子萌发延迟或抑制、根和茎发育受限以及光合效率降低。研究表明，盐胁迫期间活性氧(ROS)的过量产生会对重要的细胞组分造成氧化损伤。这一发育阶段异常敏感，未能建成健康幼苗会严重限制植物群体并最终降低作物产量。因此，制定策略以减轻这些初始阶段的盐胁迫，对于保护幼苗、增强其代谢能力以确保高产和可持续农业至关重要。
硝普钠(SNP)作为一氧化氮(NO)供体，是一种活性氮物种。其在植物信号传导中的作用及其与植物生长发育过程的关联现已得到认可。NO已被确认为生物和非生物胁迫响应中的信号分子。SNP可以缓解种子在盐分、水分亏缺、高温和重金属等胁迫条件下的萌发损伤。据报道，NO可以触发抗氧化酶的活性，从而清除幼苗在胁迫生长过程中产生的活性氧(ROS)。外源NO处理被发现可以通过将超氧阴离子(O2•?)解毒为H2O2和O2，来保护植物细胞免受各种胁迫引起的氧化应激。清除H2O2的酶，如抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化氢酶(CAT)的活性也增加了，导致胁迫条件下根线粒体中H2O2积累减少。同样，一些研究报道SNP预浸泡增加了非酶含量和各种抗氧化酶的活性，在胁迫条件下改善了膜完整性。这些研究表明，通过NO信号传导可能促进了增强的酶活性和代谢活动，从而诱导了在各种胁迫条件下生长的萌发种子的胁迫耐受性。
尽管已有报道指出NO在缓解茄子幼苗盐胁迫中的保护作用，表明以SNP形式提供的NO作为信号分子，通过显著降低脂质过氧化(MDA)、上调抗氧化酶活性(CAT和SOD)以及改善光合性能来减轻胁迫，但SNP对盐胁迫下种子萌发和最早幼苗建成阶段的影响仍 largely unexplored。基于SNP在减轻植物胁迫诱导损伤中的保护作用，本研究假设SNP应用可以通过激活多种胁迫响应途径，包括抗氧化防御系统，来增强泰国茄子对盐胁迫的耐受性。因此，本研究旨在评估SNP预处理对盐胁迫条件下泰国茄子种子萌发和幼苗生长的影响。确定了提高老化种子活力、幼苗活力和胁迫耐受性的最佳SNP浓度。本研究结果可用于缓解盐胁迫下茄子种子萌发的问题。
2. 材料与方法
2.1. 植物材料与处理
泰国茄子品种‘昭披耶’的种子购自泰国曼谷的Kamlai Tong Agriculture Co. Ltd.，使用前在4°C黑暗条件下储存。种子在不同浓度(0, 0.05, 0.1, 和 0.2 mM)的SNP溶液中于25°C黑暗条件下浸泡24小时。选择24小时预处理时间基于初步试验和先前报道，表明在此时间内能有效吸收NO且不诱导植物毒性。浸泡后，种子用蒸馏水冲洗三次，均匀放置在铺有滤纸的培养皿中，滤纸用0, 100, 和200 mM的NaCl溶液饱和。培养皿在25 ± 1°C（被认为是茄子种子萌发的最适温度）、80–90%相对湿度、12小时光照/12小时黑暗的光周期下培养。实验采用完全随机设计(CRD)，每个处理5个重复，每个重复50粒种子。
2.2. 萌发特性
每天记录萌发情况，持续十天。当胚根长度超过2毫米时视为萌发。发芽率在第十天计算。
50%萌发时间(T50)根据Seguí等人的方法稍作修改计算。平均萌发时间(MGT)作为平均萌发速度的指标，根据Ellis和Roberts的公式计算。萌发速度系数(CVG)基于发芽试验期间每天萌发的种子数计算。幼苗活力指数(SVI)按照Abdul-Baki和Anderson的方法计算。计算萌发指数(GI)以评估萌发速率和均匀度。
2.3. 幼苗生长测量
从以下形态参数分析幼苗生长：胚根和胚芽的鲜重(FW)以及胚根和胚芽的长度。在第十天结束时，用毫米尺测量泰国茄子幼苗的茎和根长度。测量每种条件下分离的茎和根的鲜重。
2.4. 过氧化氢(H2O2)含量的测定
H2O2含量测定遵循Junglee方法的改良法。将整个泰国茄子幼苗(0.2克)在液氮中研磨。然后加入1毫升均质化溶液，该溶液包含50 mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、0.1% (w/v)三氯乙酸(TCA)和1 M碘化钾。混合物在4°C下12,000×g离心20分钟，将所得上清液转移至紫外微孔板。样品在黑暗中孵育20分钟，然后在350 nm记录吸光度。使用标准H2O2校准曲线确定H2O2含量，表示为μmol·g?1。
2.5. 丙二醛(MDA)含量的测量
MDA含量分析遵循Ummarat方法的改良法。整个幼苗在液氮中研磨，然后与1毫升5% (w/v) TCA涡旋混合。混合物在4°C下12,000×g离心20分钟。然后将0.5毫升上清液转移至新的微量离心管中，与0.5毫升含有0.5% (w/v)硫代巴比妥酸的15% TCA涡旋混合。充分混合后，溶液在95°C加热30分钟。将管置于冰浴中终止反应，然后在12,000×g离心10分钟。读取532 nm和600 nm的吸光度值。使用公式计算MDA浓度。
2.6. 过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性
使用Song和Yu方法的改良法分析CAT和APX活性。植物样品(0.2克)在研钵中用液氮研磨，然后在含有50 mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)和1% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的提取缓冲液中匀浆。匀浆液在4°C下12,000×g离心20分钟。
使用反应混合物分析CAT活性，该混合物包含50 mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、5 mM H2O2和上清液。使用240 nm处的摩尔消光系数(43.6 mM?1cm?1)测量CAT活性。
APX活性在含有50 mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、10 mM EDTA、20 mM抗坏血酸、5 mM H2O2和酶提取物的反应混合物中测定。使用2.8 mM?1cm?1的摩尔消光系数在290 nm记录吸光度的下降。两种酶活性均表示为每毫克蛋白单位(U mg?1)。
2.7. 统计分析
数据采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析。使用Duncan多重范围检验在p < 0.05显著性水平下进行处理间平均分离。所有统计分析均使用R软件Version 2025.09.1+401及其‘agricolae’包进行。使用‘stats’包中的‘prcomp’函数进行主成分分析(PCA)，并使用‘factoextra’包可视化结果。使用‘pheatmap’包生成带有层次聚类的热图。计算Pearson相关矩阵并使用‘corrplot’包以相关图形式可视化。所有数据操作和准备均使用‘tidyverse’系列包完成。
3. 结果
3.1. SNP对盐胁迫下泰国茄子种子萌发的影响
结果表明，高盐胁迫(200 mM NaCl)显著降低了泰国茄子种子的发芽率，与对照和中度盐胁迫(100 mM NaCl)处理相比。施用0.05 mM SNP提高了高盐胁迫条件(200 mM NaCl)下茄子种子的发芽率。0.2 mM SNP处理改善萌发的效果低于较低浓度。
盐胁迫显著延迟了茄子种子的萌发。在无盐条件下，T50随着0.1和0.2 mM SNP处理而增加。然而，在高盐胁迫(200 mM NaCl)下，SNP应用显著缩短了这种延迟。
类似地，盐胁迫增加了平均萌发时间(MGT)，最长记录在200 mM NaCl下。在这种高盐条件下，施用SNP，特别是0.05和0.1 mM，显著降低了MGT。相反，萌发速度系数(CVG)随着盐度水平的增加而显著降低。发现SNP预处理在100和200 mM NaCl胁迫下改善了CVG，表明萌发速度更快。
还评估了萌发指数(GI)和幼苗活力指数(SVI)以确定萌发和幼苗建成的整体成功率。两种指数均被盐胁迫严重降低，最低值出现在200 mM NaCl下。然而，SNP的应用有效地减轻了这种负面影响。在高盐胁迫下，与盐胁迫对照相比，用0.05和0.1 mM SNP预处理导致GI和SVI显著增加。
3.2. SNP对盐胁迫下泰国茄子幼苗生长的影响
盐胁迫严重阻碍了茄子幼苗的生长。茎长度在100和200 mM NaCl处理中均显著减少。SNP在胁迫下促进了茎的伸长。在100 mM NaCl下，0.1和0.2 mM SNP使茎长度从约8毫米增加到10毫米以上。SNP效应在高胁迫(200 mM NaCl)下更为明显，与胁迫对照相比，SNP应用使茎长度增加了50–100%。
茄子幼苗的根长度也受到盐胁迫的显著抑制。SNP对根长的缓解作用不如对茎长明显。然而，在根几乎不生长的200 mM NaCl下，SNP处理显示长度与对照相比有微小但可见的增加。
茄子茎生物量在盐胁迫条件下显示出与茎和根长度相似的负趋势。SNP在盐胁迫条件下显著增强了生物量积累。在200 mM NaCl下，0.05 mM SNP处理使茎鲜重增加了100%。
类似地，茄子根生物量对高盐胁迫条件(200 mM NaCl)极其敏感。观察到SNP处理 consistently exhibited a positive effect。在100 mM NaCl下，0.05 mM SNP增加了根鲜重。在最高胁迫水平(200 mM NaCl)下，SNP处理导致根鲜重略高于胁迫对照，表明根生物量得到部分恢复。
3.3. SNP对盐胁迫下泰国茄子幼苗丙二醛(MDA)含量的影响
MDA含量是细胞膜氧化损伤的关键生物标志物。在100和200 mM NaCl处理下萌发的泰国茄子幼苗中，MDA含量增加。与对照处理相比，0.05 mM SNP应用对MDA含量无显著影响，尽管显示MDA水平略有降低。
3.4. SNP对盐胁迫下泰国茄子幼苗过氧化氢(H2O2)含量的影响
盐胁迫导致有毒活性氧(ROS) H2O2积累显著增加，表明泰国茄子幼苗中诱导了氧化应激。在盐胁迫条件下施用SNP倾向于减少H2O2积累，但处理间未发现显著差异。
3.5. SNP对盐胁迫下泰国茄子幼苗CAT和APX活性的影响
CAT活性在所有NaCl浓度和SNP水平下的处理间均无显著差异。尽管在没有SNP处理的幼苗中，CAT活性在中度盐胁迫(100 mM NaCl)下略有下降，在高盐胁迫(200 mM NaCl)下略有增加，但这些变化无统计学意义。类似地，SNP应用在任何盐度水平下均未显著改变CAT活性。
盐胁迫显著提高了APX活性，但在较高盐度水平下未进一步增加。最显著的增加出现在未用SNP处理的种子中。然而，在高盐胁迫条件下，SNP处理和未处理种子之间未发现统计学显著差异。
3.6. 多变量分析
为了更好地理解整体响应模式，使用主成分分析(PCA)进行了多变量分析。PCA揭示了基于生理和生化参数的处理间清晰分离。第一主成分(Dim1)解释了总变异的75.9%，而第二主成分(Dim2)解释了9.0%。
观察到处理间根据盐度水平有明显的分离。非盐水处理(0 mM NaCl)聚集在图的左侧，而盐胁迫处理(100和200 mM NaCl)位于右侧。这种分布表明盐胁迫是影响幼苗响应的主要因素。双标图中的箭头代表测量的参数。与生长相关的性状，如发芽率(GP)、SVI和茎长(SL)朝向非盐水处理，而与胁迫相关的标志物，如MDA和H2O2与盐胁迫处理相关。
代表CAT和APX活性的向量指向SNP处理的样本，表明SNP处理与增强的抗氧化酶活性之间存在正相关关系。总体而言，PCA证明0.05 mM SNP通过增强抗氧化防御和维持泰国茄子种子的萌发活力，有效缓解了盐诱导的胁迫。
生成热图以进一步检查每个参数在不同处理中的变异。热图显示了所有十二个处理的平均值，其中红色代表较高值，蓝色代表较低值。识别出两个主要的参数簇。第一个簇包含与生长相关的参数，如GP、SVI和SL。这些参数在非盐水处理中表现出高（红色）值，在盐胁迫处理中表现出低（蓝色）值。
第二个簇包括胁迫相关标志物MDA和H2O2，以及抗氧化酶活性(CAT和APX)。该组显示出相反的趋势，在高盐度处理中显示较高（红色）值。热图还揭示了SNP应用的有益效果。在200 mM NaCl胁迫下，当施用SNP时，MDA的红色强度降低，表明脂质过氧化和氧化损伤减少。
最后，使用相关图检查了所有测量参数之间的关系。在生长相关参数之间观察到强正相关。例如，SVI与SL显示出显著正相关，表明这些性状在有利条件下同时增加。相反，在生长参数和胁迫标志物之间检测到负相关。特别是在SVI和MDA之间发现了强负相关，表明较高的脂质过氧化水平与降低的幼苗活力相关。
4. 讨论
本研究证明SNP显著增强了盐胁迫下泰国茄子的种子萌发和早期幼苗生长。高盐度(200 mM NaCl)施加了严重的生理限制，延迟了萌发并抑制了幼苗发育。然而，外源施用SNP有效减轻了这些有害影响，特别是在早期生长阶段。这些结果凸显了SNP作为NO供体在改善盐胁迫下泰国茄子栽培的耐盐性和促进幼苗建成的潜力。
盐诱导的萌发延迟，如50%萌发时间(T50)所示，可能是由于种子启动防御响应和建立渗透平衡的能力有限。SNP的应用，特别是0.05 mM，提高了萌发率，并显著降低了高盐胁迫下的T50。这表明了一种引发效应，即NO增强了种子更快速调动资源和激活胁迫响应机制的能力。这些结果与先前报道一致，表明NO在种子萌发过程中促进渗透调节并刺激抗氧化防御。
盐度的负面影响也通过较高的MGT和较低的CVG显示出来。较高的MGT表明萌发过程较慢且效率较低。在高盐胁迫下，SNP的应用降低了MGT并提高了CVG，证明SNP促进了更快、更均匀的萌发。这种萌发动力的改善对于在不利环境条件下成功建植作物至关重要。
此外，GI和SVI在高盐度下均显著降低，反映了盐胁迫对萌发和早期幼苗生长的整体抑制作用。SNP预处理在盐渍条件下显著改善了GI和SVI。这种增强表明NO信号传导有助于加强幼苗性能并改善对胁迫环境的耐受性。
幼苗生长数据进一步支持了SNP在盐胁迫下的保护作用。盐胁迫严重抑制了茎和根的伸长以及生物量积累。SNP的应用，特别是0.05–0.1 mM，部分缓解了这些抑制效应并恢复了生长性能。茎长的改善比根长更明显，特别是在200 mM NaCl下，表明茎可能更受益于NO介导的激素调节和抗氧化保护。据报道NO调节生长素信号传导，直接促进茎细胞伸长。尽管SNP对根生长的影响相对 modest，但观察到的根生物量增加值得注意，因为即使在高盐条件下，NO也可能增强离子选择性和水分吸收效率。
盐胁迫触发ROS（包括H2O2）的过量产生，从而损害细胞组分。这通过盐处理下H2O2水平和脂质过氧化(MDA测量)的显著增加得以证明。SNP处理在中度和高盐胁迫下均显著降低了H2O2积累，表明ROS清除能力增强。尽管SNP仅略微降低了MDA含量，但趋势表明NO在限制膜损伤方面具有保护作用。
在高盐胁迫下，如升高的H2O2和MDA水平所示，APX活性 initially increased，反映了植物试图解毒过量的ROS。这种模式与棉花幼苗中的发现一致，其中增强的抗氧化酶活性与强化的氧化应激响应相关。然而，这种响应在200 mM NaCl时达到饱和点，表明抗氧化酶系统无法再有效清除活性氧。SNP的应用在高盐胁迫下并未显著增强APX活性，表明在严重胁迫水平下酶响应性有限。类似地，CAT活性在SNP处理和未处理幼苗中均显示可变波动，暗示当酶防御不足时，非酶抗氧化机制可能有助于ROS调节。
多变量分析提供了关于盐度和SNP如何影响泰国茄子幼苗的整体视图。PCA揭示处理主要根据NaCl浓度分离，表明盐胁迫是塑造整体生理和生化响应的主导因素。这一发现与先前报道一致，表明高盐度施加渗透胁迫和离子毒性，共同限制植物生长和发育。
然而，结果也表明了SNP对抗盐诱导氧化应激的保护作用。热图分析揭示，尽管盐度增加了MDA积累，但SNP应用减轻了这种上升。因为MDA是膜脂质过氧化的成熟标志物，其在SNP处理下的减少表明NO有助于保持细胞膜完整性。维持膜稳定性是增强植物胁迫耐受性的关键机制。这一观察结果与先前报道一致，证明从SNP释放的NO可以减轻各种非生物胁迫下的氧化损伤并改善细胞保护。
相关矩阵进一步阐明了硝普钠(SNP)保护作用的潜在机制。在抗氧化酶活性和MDA含量之间观察到强负相关。这种反比关系表明较高的抗氧化酶活性与较低的氧化损伤水平相关。由于SNP处理的幼苗表现出降低的脂质过氧化和改善的生长性能，SNP很可能增强了植物内在的抗氧化防御能力。这些发现支持了以下假设：即NO供体如SNP激活抗氧化酶以清除ROS，从而减轻氧化应激并保护植物免受盐诱导的细胞损伤。
5. 结论
本研究表明，作为外源NO供体的SNP主要在萌发和早期幼苗建成阶段增强了泰国茄子对盐胁迫的耐受性。升高的NaCl浓度诱导了氧化应激，导致ROS积累增加和膜脂质过氧化。SNP处理通过减轻氧化损伤和稳定氧化还原稳态，部分缓解了这些效应，这反映在H2O2、MDA和APX的变化上。尽管在这个早期发育阶段，生化变化的幅度适中，但相关分析证实了氧化应激强度、抗氧化酶激活和受损萌发动力学之间的密切关联。这些发现支持了NO在早期胁迫驯化中的调节作用；然而，更深层的分子和信号传导机制需要在未来研究中进一步探讨。
