《Plant Communications》：Targeted editing of TaROD1 confers disease resistance to both Fusarium head blight and powdery mildew in wheat without growth penalty
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本研究针对小麦赤霉病(FHB)抗性遗传基础狭窄、过度依赖Fhb1单一基因座的问题，通过CRISPR/Cas9技术靶向编辑小麦免疫负调控因子TaROD1，成功创制了同时兼具赤霉病和白粉病双重抗性且农艺性状无显著变化的突破性种质，为小麦广谱抗病育种提供了新策略。
小麦作为全球最重要的粮食作物之一，其安全生产始终面临着多种病害的严重威胁。其中，由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起的赤霉病（Fusarium Head Blight, FHB）不仅造成产量大幅下降，还会产生真菌毒素污染谷物，直接危害人畜健康。尽管育种家们已经付出了数十年的努力，但赤霉病的有效防控依然是个世界性难题。目前，小麦抗赤霉病育种主要依赖于一个名为Fhb1的关键数量性状位点（QTL），该位点自发现以来已成为全球抗赤霉病育种计划的基石。然而，这种过度依赖单一抗性基因的策略存在巨大风险，一旦病原菌发生适应性变异导致Fhb1抗性失效，将对全球小麦生产安全构成严重威胁。因此，挖掘新的抗病基因资源、开发不依赖于Fhb1的广谱持久抗病新策略，是小麦育种领域的迫切需求。
在植物与病原菌的长期博弈中，植物进化出了精妙的多层防御机制。然而，在没有病原菌侵染时持续激活免疫反应会消耗大量能量，导致生长受阻，即产生所谓的“生长代价”（fitness penalty）。为了平衡抗病与生长，植物体内存在一类被称为“免疫抑制子”（immune suppressor）的调控元件，它们负责在平时“踩刹车”，避免免疫系统过度激活。对这些抑制子进行精准的遗传操作，被认为是培育广谱抗病作物品种的有效途径。此前，在水稻中的研究发现，一个名为ROD1（Suppressor of npr1-1 Induced 1）的基因是关键免疫负调控因子。敲除OsROD1会导致活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的持续积累，触发自身免疫反应，从而赋予水稻对稻瘟病、白叶枯病和纹枯病等多种主要病害的广谱抗性。进一步机制研究表明，ROD1蛋白能够与OsTIR（Toll/Interleukin-1 Receptor）蛋白相互作用，抑制其酶活性和后续免疫激活代谢物pRib-AMP的产生。当植物感知到病原菌入侵时，ROD1会通过蛋白酶体途径被降解，从而解除对OsTIR-pRib-AMP通路的抑制，激活广谱抗性。这些发现确立了ROD1作为水稻免疫调控核心“感病基因”（susceptibility gene）的地位，使其成为遗传改良提高作物抗病性的理想靶点。然而，ROD1基因在小麦这一重要谷物中的功能及其抗病育种潜力尚属未知。
为了回答上述问题，研究人员在《Plant Communications》上发表了题为“Targeted editing of TaROD1 confers disease resistance to both Fusarium head blight and powdery mildew in wheat without growth penalty”的研究论文。该研究首次在小麦中揭示了TaROD1的功能，并通过先进的基因编辑技术，成功创制了兼具赤霉病和白粉病双重抗性且不牺牲产量的新型小麦材料，为小麦抗病育种开辟了新路径。
本研究主要运用了几个关键技术方法：首先，通过生物信息学分析鉴定了小麦中的TaROD1同源基因；其次，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在“Fielder”小麦品种中对三个TaROD1同源基因（TaROD1-4A, TaROD1-7A, TaROD1-7D）进行同步敲除，并筛选获得纯合突变体；然后，通过温室和田间试验系统评估了突变体的抗病性（针对赤霉病菌F. graminearum和白粉病菌Blumeria graminis f. sp. tritici, Bgt）和关键农艺性状；最后，采用RNA测序（RNA-seq）技术比较野生型和突变体在病原菌侵染不同时间点的转录组变化，并利用组织化学染色和定量方法检测了活性氧（ROS）积累。
TaROD1同源基因的鉴定与突变体创制
研究人员首先在小麦基因组中鉴定出三个水稻OsROD1的同源基因，分别位于4A、7A和7D染色体上，命名为TaROD1-4A、TaROD1-7A和TaROD1-7D。蛋白序列比对和结构预测（AlphaFold）显示，小麦和水稻的ROD1蛋白在序列和核心结构上具有较高的保守性。值得注意的是，这三个TaROD1基因在接种赤霉病菌后均表现出显著的转录诱导，这与水稻中OsROD1的表达模式相似，暗示它们可能在小麦免疫中扮演类似的负调控角色。为了验证这一假设，研究团队利用CRISPR/Cas9技术，设计了两条向导RNA（sgRNA）靶向三个TaROD1同源基因的保守编码区，在“Fielder”品种中成功获得了编辑效率高、且三个同源基因均发生移码突变或大片段缺失的纯合突变体株系（如#55-2, #55-3-2, #61-4-3）。脱靶效应分析表明这些突变体是干净的。
TaROD1敲除显著增强对赤霉病和白粉病的抗性
抗病性表型鉴定是本研究的核心。在抽穗期进行赤霉病接种试验发现，与野生型相比，Tarod1突变体小麦的病小穗扩展速度显著减慢，病小穗数量和严重度明显降低，表现出极强的赤霉病抗性。幼苗期的接种试验同样证实了突变体对赤霉菌的抗性增强，病原菌生物量定量分析表明突变体中的真菌定殖量显著减少。更为重要的是，研究还发现Tarod1突变体对另一种重要叶部病害——白粉病也表现出显著增强的抗性。白粉病菌落变小，但寄主细胞死亡并未显著增加，表明这种抗性并非由NLR（Nucleotide-Binding Site Leucine-Rich Repeat）介导的免疫过度激活引起，可能是一种更为温和持久的抗性机制。
TaROD1敲除不引起生长代价
一个成功的抗病育种策略必须确保不牺牲作物的产量和农艺性状。令人振奋的是，在正常生长条件下，Tarod1突变体在株高、分蘖数、穗长、每穗小穗数、千粒重、粒宽、粒长以及单株产量等一系列关键农艺性状上与野生型相比均无显著差异。这表明敲除TaROD1所带来的抗性增益并未伴随明显的生长代价，这一点与水稻中敲除OsROD1导致严重生长缺陷形成了鲜明对比，研究者推测六倍体小麦的基因组冗余性可能缓冲了这种副作用。
无转基因残留突变体的田间验证
为了推进其育种应用，研究人员进一步分离获得了不含转基因成分的Tarod1纯合突变体株系（#55-3-12）。在自然田间条件下，该株系生长发育正常，虽然籽粒略有变小，但由于每穗粒数有所增加，其单株产量与野生型持平。更重要的是，田间赤霉病抗性评价再次证实了该无转基因突变体具有显著增强的抗病性，展现了其直接应用于育种实践的潜力。
TaROD1调控抗病性的可能机制
为了深入探究Tarod1突变体抗性增强的分子机制，研究者对接种赤霉病菌后不同时间点（0, 24, 48小时）的野生型和突变体材料进行了转录组比较分析。结果显示，在接种48小时后，突变体中上调表达的基因显著富集在“胞外区域”、“对生物刺激的响应”和“氧化还原酶活性”等GO（Gene Ontology）类别中。胞外区域是植物-病原互作的前沿阵地，其中许多基因编码病原菌相关（Pathogenesis-Related, PR）蛋白等抗菌物质。热图分析显示，多个胞外区域相关基因（如PR1s）在突变体中的表达水平显著高于野生型。此外，几丁质（chitin，真菌细胞壁成分）激发处理后，突变体颖壳中的活性氧（ROS）爆发明显增强。这些结果表明，TaROD1功能的丧失可能使小麦植株处于一种“预激活”（primed）的免疫状态，当病原菌入侵时，能够更快、更强地启动免疫反应，特别是胞外防御和氧化爆发，从而有效遏制病原菌的扩展。
综上所述，本研究首次证实了TaROD1是小麦中一个关键的免疫负调控因子，其功能在谷物间具有保守性。通过精准的基因编辑技术敲除TaROD1，能够同时赋予小麦对赤霉病和白粉病这两种毁灭性病害的强大抗性，且不牺牲农艺产量，打破了抗病性常伴随生长代价的瓶颈。尤为重要的是，该研究揭示的抗病机制独立于目前广泛使用的Fhb1位点，为小麦抗病育种提供了新的基因资源和育种策略。将TaROD1编辑与Fhb1等现有抗性基因聚合，有望产生叠加效应，培育出具有更持久、更广谱抗病性的小麦新品种，对于保障全球小麦生产的稳定和安全具有重大意义。未来的工作重点将是在更大规模、多环境下的田间试验中进一步验证这些优异种质的抗病性和适应性，推动其走向实际应用。
