《Stem Cell Reports》：Comparative lipidomics of iPSC-derived microglia protocols reveal lipid droplet and immune differences mediated by media composition
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本研究针对不同iPSC来源小胶质细胞(iMGL)分化方案存在的脂质代谢差异问题，通过比较胚胎体(EB)和诱导转录因子(iTF)两种分化方案，发现iTF微glia因缺乏B-27培养基补充剂导致甘油三酯(TG)和脂滴(LD)显著积累。研究人员证实B-27中的L-肉碱(L-car)通过促进脂肪酸β-氧化降低脂质储存，并使iTF微glia获得对免疫刺激的代谢响应能力，为神经退行性疾病研究提供了重要的培养基优化策略。
在阿尔茨海默病(AD)研究领域，小胶质细胞作为中枢神经系统的免疫卫士，其脂质代谢异常日益被视为疾病进展的关键推手。全基因组关联研究(GWAS)不断揭示出APOE、TREM2等AD风险基因与脂质代谢的密切关联，而病理状态下小胶质细胞内脂滴的异常积聚更是被证实与神经炎症反应息息相关。然而，人类原代小胶质细胞的难以获取极大限制了相关研究的深入开展，诱导多能干细胞(iPSC)技术为此提供了突破性解决方案。
目前主流iPSC分化为小胶质细胞样细胞(iMGL)的方案主要分为两类：模拟胚胎发育过程的胚胎体(EB)分化法，以及通过诱导关键转录因子快速生成的iTF法。前者虽能较好模拟小胶质细胞特性，但耗时长达数周且成本高昂；后者仅需8天即可获得大量细胞，为大规模药物筛选提供了可能。然而，这两种方案所得细胞在脂质代谢状态是否存在差异，以及这种差异对疾病建模可靠性的影响，尚属未知领域。
为解答这一关键问题，研究团队对两种分化方案进行了系统的脂质组学比较分析。研究发现iTF微glia呈现出显著的脂质代谢异常，其细胞内甘油三酯(TG)含量达到EB微glia的10倍以上，伴随脂滴标记蛋白PLIN2的显著上调。通过培养基互换实验，团队将差异根源锁定在培养基成分——EB培养基特有的B-27补充剂。进一步机制探究发现，B-27中的关键成分L-肉碱(L-car)能够促进脂肪酸进入线粒体进行β-氧化，从而有效降低脂质储存。更有意义的是，B-27补充不仅使iTF微glia脂质代谢正常化，还使其获得了对脂多糖(LPS)刺激的恰当反应能力，并显著提升稳态标记物P2RY12的表达水平。
本研究主要采用iPSC培养与定向分化、脂质组学分析、免疫荧光染色、Western blot蛋白质印迹、流式细胞术以及qRT-PCR定量逆转录聚合酶链反应等关键技术方法。实验使用了WTC11和KOLF2.1J两种iPSC细胞系，通过标准化流程分别获得EB微glia和iTF微glia进行对比研究。
研究结果
性质迥异的分化方案特征
研究人员首先系统比较了两种分化方案的技术路线与细胞表型。EB方案通过胚胎体形成模拟小胶质细胞发育过程，耗时约5周；而iTF方案通过诱导MAFB、PU.1等6个关键转录因子表达，仅需8天即可获得功能性小胶质细胞。两种方案获得的细胞均表达小胶质细胞标志物IBA1，但转录组分析显示iTF微glia高表达TMEM119和干扰素信号通路相关基因，而EB微glia则保留更多巨噬细胞特征。最引人注目的是，iTF微glia呈现显著的脂滴积聚现象，PLIN2阳性细胞比例和蛋白表达水平均显著高于EB微glia。
脂质组学揭示中性脂质异常积聚
通过高通量脂质组学分析，研究团队在两种iMGL中鉴定出1009种脂质物种，涵盖16个脂质类别。主成分分析(PCA)显示两种细胞的脂质组存在明显分离。虽然EB微glia总脂质浓度更高，但iTF微glia的甘油三酯(TG)比例异常升高，占其脂质组的11%以上，而EB微glia仅占1%。同时，TG前体二酰甘油(DG)也在iTF微glia中显著富集。相反，EB微glia则含有更多磷脂酰丝氨酸(PS)和己糖神经酰胺(HexCER)。值得注意的是，大多数TG物种在iTF微glia中普遍升高，未发现特定饱和度物种的特异性积聚。
培养基成分是关键决定因素
为探究差异来源，研究人员将EB微glia置于iTF培养基中培养(EB-iTF)，发现这些细胞的TG水平和PLIN2表达均显著上升，而总脂质浓度保持不变。这表明培养基成分而非分化方法本身是导致脂质差异的主因。培养基脂质组成分析显示，两种培养基的脂肪酸含量相当，甚至EB培养基的TG和DG浓度更高，排除了直接脂质补充导致差异的可能性。
B-27补充剂调控甘油三酯代谢
通过逐一筛选培养基差异成分，团队发现B-27补充剂的缺失是导致TG积聚的关键因素。将B-27从EB培养基中剔除后，EB微glia的TG水平显著上升；反之，向iTF培养基中添加B-27则显著降低TG、DG和脂肪酸水平，同时减少PLIN2蛋白表达。有趣的是，HexCER的变化与TG呈现相反趋势，B-27补充促进了HexCER的积累。
脂质状态决定免疫表型
鉴于脂滴积聚与炎症状态的相关性，研究团队进一步评估了B-27对iTF微glia免疫表型的调节作用。流式细胞术分析显示，B-27补充显著降低了疾病相关标记物(SPP1、CD9、LGALS3)、干扰素应答标记物(CXCL10、IFIT1)和趋化因子CCL13的表达，同时上调了稳态标记物P2RY12。更重要的是，B-27使iTF微glia获得了对LPS刺激的正常代谢响应能力——未补充B-27的细胞对LPS刺激无反应，而补充组则表现出典型的脂滴诱导现象。
L-肉碱部分模拟B-27效应
机制层面，研究人员聚焦于B-27中的关键成分L-肉碱(L-car)，这是长链脂肪酸进入线粒体进行β-氧化的必需辅因子。实验证实，单独添加L-car即可显著降低iTF微glia的TG、DG和脂肪酸水平，减少PLIN2表达，并部分重现B-27对免疫标记物的调节作用，包括降低LGALS3和CXCL10表达，提升P2RY12水平。这表明L-car介导的脂肪酸氧化促进是B-27调节脂质代谢的核心机制之一。
研究结论与意义
本研究通过系统比较两种iPSC来源小胶质细胞分化方案的脂质组学特征，揭示了培养基成分对细胞代谢状态的深刻影响。研究证实iTF微glia中观察到的脂滴积聚和TG升高主要源于B-27补充剂的缺失，特别是其中L-肉碱的缺乏导致脂肪酸β-氧化受阻。这一发现不仅解释了不同分化方案间的代谢差异，更提供了通过简单培养基优化即可改善iMGL功能状态的实用策略。
从更广阔的视角看，这项工作强调了细胞培养条件在疾病建模中的关键作用。在阿尔茨海默病等神经退行性疾病研究中，小胶质细胞的脂质代谢异常已成为焦点领域，而本研究为相关体外研究提供了重要的质量控制参考。通过调整培养基成分，研究人员可以更精确地模拟生理或病理状态下的脂质代谢特征，提升疾病模型的可靠性。
值得注意的是，虽然L-car部分模拟了B-27的效应，但其对P2RY12的促进作用较弱，提示B-27中其他成分也对微glia稳态具有重要调节作用。这为未来研究留下了有趣的空间——进一步解析B-27的活性成分及其协同作用机制，将有助于开发更优化的微glia培养体系。
这项发表于《Stem Cell Reports》的研究不仅为干细胞领域提供了重要的技术洞察，也为神经科学和疾病研究提供了可立即应用的实践指南，强调在利用iPSC技术进行疾病建模时，必须充分考虑分化方案和培养条件对细胞代谢状态的潜在影响，以确保研究结果的可靠性和生理相关性。
