发育过程中的壬基酚暴露会触发依赖GPER（G protein-coupled receptor for eicosanoids）的小胶质细胞活化，进而导致神经元损伤

《Journal of Hazardous Materials》：Developmental Nonylphenol Exposure Triggers GPER?Dependent Microglial Activation and Subsequent Neuronal Injury

非yl酚（NP）发育暴露通过激活小胶质细胞GPER及其下游EGFR-STAT3信号通路引发海马神经元损伤，并伴随M1极化及促炎因子失衡，敲低GPER可缓解上述效应，而STAT3激活则抵消保护作用。

　　

作者：Dianqi Yao、Siyu Yan、Rui Ding、Bingcheng Cai、Siyao Li、Yuanyuan Xu、Yi Wang

中国医科大学环境压力与慢性病控制与预防重点实验室，教育部，中国辽宁省沈阳市

摘要

壬基酚（NP）是一种重要的环境雌激素和污染物，因其神经毒性而受到广泛关注。小胶质细胞的激活可能是NP诱导神经元损伤的主要因素，但其背后的机制尚不清楚。我们假设GPER（一种对NP敏感的新型G蛋白偶联雌激素受体）及其下游信号通路介导了NP诱导的小胶质细胞激活和随后的神经元损伤。为了验证这一假设，我们建立了一种在大鼠中暴露于不同浓度NP的模型。此外，我们还开发了一种共培养系统，该系统包含暴露于NP的HMC3小胶质细胞和分化的SH-SY5Y神经元。发育过程中的NP暴露导致大鼠出现学习和记忆缺陷以及海马区神经元损伤，同时伴有小胶质细胞的M1极化及促炎细胞因子的变化。组学分析表明GPER是NP的潜在靶点，这一结论得到了海马区GPER及下游EGFR-STAT3信号通路激活的支持。这些变化在体外培养的NP暴露HMC3小胶质细胞中得到了证实。在共培养体系中，NP暴露的小胶质细胞产生的条件培养基严重损害了SH-SY5Y神经元。GPER敲低（GPER-KD）可减轻NP诱导的小胶质细胞激活、M1极化及促炎细胞因子变化，从而减少神经元损伤。然而，特异性激活小胶质细胞中的STAT3会抵消GPER-KD的保护作用。总之，研究表明NP通过以小胶质细胞为中心的炎症反应导致神经元损伤，其中小胶质细胞的GPER及其下游EGFR-STAT3信号通路起着关键作用。

引言

壬基酚（NP）是一种典型的环境雌激素，在多种工业过程和个人护理产品中广泛使用[1]。人为造成的NP污染在全球许多国家和地区的空气、土壤和水体中普遍存在[2]。人类接触NP的主要途径包括摄入、皮肤接触和吸入[3]。使用特殊涂料的工人可能每天接触到高达2 mg/kg的NP，而生活在纺织厂附近的人可能接触到高达6.4 mg/kg的NP[4]。基于生理学的药代动力学（PBPK）建模和生物监测表明，某些人群的 external 暴露量可能高达63.9 mg/kg/天[5]。由于NP具有高脂溶性，它容易在人体组织（包括大脑和脂肪）中积累[6]。值得注意的是，即使没有职业暴露，女性脂肪组织中也检测到了NP，且有证据表明NP能够穿过胎盘屏障。孕妇和哺乳期妇女的血液、人乳和羊水以及胎儿的胎盘和脐带血中都发现了NP水平的升高[7][8][9][10]。 神经系统对环境雌激素的毒性作用非常敏感。流行病学研究和实验室研究表明，即使低水平的NP暴露也会损害学习和记忆能力[11][12]。作为最常见的环境雌激素之一，NP即使在低浓度下也会损害认知功能[13][14]。例如，有研究表明产前暴露于NP会降低学龄前儿童的智商[15]。我们之前的研究也表明，发育过程中的NP暴露会干扰大鼠的海马长时程增强（LTP）并降低Morris水迷宫表现[16]。这些研究表明，NP暴露，尤其是在神经发育的关键阶段，会对中枢神经系统（CNS）产生显著影响。然而，导致这些效应的机制尚未明确。

小胶质细胞是大脑的主要免疫细胞，也是中枢神经系统中炎症细胞因子的主要来源[17]。小胶质细胞的异常激活及其引发的过度释放炎症细胞因子会导致神经元损伤、破坏神经结构和功能[18][19][20]，并导致神经系统疾病和大脑发育异常[21][22]。外源性有害物质很可能通过小胶质细胞发挥其神经毒性作用。

雌激素受体（ERs）是一组广泛分布于各种组织细胞膜和细胞核中的受体蛋白，分为“膜ER”和“核ER”[23]。一些能够穿透血脑屏障的环境雌激素会影响这些ER在膜和细胞核中的活性，从而激活小胶质细胞，导致促炎细胞因子的过度产生，并对神经系统造成损害[24][25]。值得注意的是，某些环境雌激素（尤其是NP）与“核ER”的结合亲和力大约是内源性雌激素雌二醇（E2）的万分之一[26]。鉴于这些发现，应进一步研究“膜ER”在环境雌激素NP诱导的小胶质细胞炎症激活中的作用。

大多数“膜ER”是新型雌激素受体，其中G蛋白偶联雌激素受体（GPER）最为突出[27]。有趣的是，虽然E2可以通过GPER抑制促炎反应，但某些外源性有害物质被认为会异常激活GPER及其下游信号通路，最终导致炎症细胞因子的过度产生[28][29][30]。多项研究表明NP与GPER有高结合亲和力，这可能导致GPER介导的信号通路和细胞反应发生显著改变[31][32]。此外，GPER在小胶质细胞中表达丰富，使其成为环境雌激素在中枢神经系统中的潜在靶点[33]。我们之前的研究及其他研究均发现NP暴露会导致小胶质细胞异常激活[34][35]。因此，有理由假设NP作为一种典型的环境雌激素，可能会异常激活GPER，导致小胶质细胞反应和炎症细胞因子水平的变化，最终引发神经毒性。研究表明GPER可以调节表皮生长因子受体（EGFR）-信号转导子和转录激活因子3（STAT3）的信号通路[36]。通过调节炎症细胞因子的表达，EGFR-STAT3信号通路对炎症过程起着重要作用[37]。在HaCaT细胞模型中，EGFR-STAT3信号通路的激活可显著上调白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）[38]。在急性肾损伤的小鼠和HK-2细胞模型中，常用的化疗药物顺铂可激活EGFR-STAT3信号通路，导致TNF-α和IL-1β的上调，从而加剧肾脏炎症[39]。因此，我们认为GPER及其介导的EGFR-STAT3信号通路是NP诱导的小胶质细胞异常激活和炎症细胞因子产生的关键受体和分子机制。

总之，NP暴露，尤其是在神经发育期间，会损害神经系统，尽管其背后的机制尚未阐明。小胶质细胞的炎症激活会严重破坏神经系统的形态和功能，而小胶质细胞中的GPER可能是NP的作用靶点。因此，我们建立了一种在妊娠和哺乳期间暴露于不同浓度NP的大鼠模型，并研究了其对后代学习和记忆以及神经元损伤的影响。随后，我们探讨了NP暴露对小胶质细胞激活和炎症细胞因子产生的影响，特别关注GPER及其在介导的小胶质细胞激活中的EGFR-STAT3信号通路。为了确认GPER及其下游EGFR-STAT3信号通路是否参与小胶质细胞的激活和炎症细胞因子的增加，我们还使用了具有稳定GPER敲低（GPER-KD）的人类HMC3小胶质细胞建立暴露模型。此外，我们还使用了包含HMC3或GPER-KD细胞和人类SH-SY5Y神经元的共培养系统来验证NP是否可以通过GPER及其下游信号通路介导的小胶质细胞炎症激活来诱导神经元损伤。在这些共培养系统中，我们用STAT3信号激活剂Colivelin trifluoroacetate（TFA）处理GPER-KD HMC3小胶质细胞，进一步探讨了NP诱导的神经元损伤的受体和分子机制。

动物

实验所用的大鼠（体重260-280克）来自中国医科大学实验动物中心。本研究中的所有动物实验均获得了中国医科大学动物伦理委员会的批准，并遵循国际动物保护和福利指南进行。大鼠可以自由摄取改良的AIN-93G饲料（旨在减少植物雌激素的干扰）和纯净水。适应环境后，将大鼠配对饲养

发育过程中的NP暴露会损害学习和记忆

为了评估NP发育过程中的暴露对学习和记忆的影响，我们使用了Morris水迷宫测试，该测试常用于测量学习和记忆能力[42]。在50 mg/kg NP组中，进入平台区的次数和在平台区停留的时间显著减少（图1C-E；P < 0.05）。在2 mg/kg和10 mg/kg NP组中也观察到了这些指标的改变

讨论

近年来，人们对NP的神经毒性越来越关注。由于NP与天然雌激素相似，它被归类为外源性雌激素。值得注意的是，NP对GPER具有高亲和力，而GPER是一种在小胶质细胞中大量表达的新型雌激素受体[50][51]。小胶质细胞是大脑中炎症细胞因子的主要来源。先前的研究发现，以小胶质细胞为中心的炎症激活会严重影响中枢神经系统（CNS）。我们的研究旨在确定...

结论

总之，NP发育过程中的暴露通过以小胶质细胞为中心的炎症反应导致神经元损伤。小胶质细胞中的GPER通过EGFR–STAT3信号通路介导小胶质细胞的激活，促使细胞从M2状态转变为M1状态，并促进促炎细胞因子的产生，最终导致神经元损伤。本研究强调了小胶质细胞中的GPER在NP诱导的神经毒性中的重要性，并表明靶向小胶质细胞中的GPER可能是一种有效的干预措施

环境影响声明

壬基酚（NP）是一种对人类健康构成严重风险的有害环境雌激素，已被欧盟列为优先危险物质，并被列入美国有毒物质清单。

NP的神经毒性已被证实，且可能与小胶质细胞激活有关；然而，其具体机制仍有待阐明。我们的研究表明，在与人类暴露相关的浓度下，NP的发育过程暴露会通过以小胶质细胞为中心的炎症反应导致神经元损伤

作者贡献声明

Siyu Yan：研究、数据整理。 Rui Ding：研究。 Yuanyuan Xu：写作、审稿与编辑、资金获取、概念构思。 Yi Wang：写作、审稿与编辑、资金获取、概念构思。 Bingcheng Cai：研究。 Siyao Li：研究。 Dianqi Yao：写作——初稿撰写、研究、资金获取、数据分析、数据整理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（82504373和81973081）、辽宁省科技项目（2023JH2/101300038）、辽宁省杰出青年基金项目（2024JH3/50100025）以及辽宁省青年科学家科技创新团队项目（3110024075）的支持。