斑马鱼发育过程中接触铅所导致的脂质组学及神经行为变化

《Journal of Hazardous Materials》：Lipidomic and Neurobehavioral Alterations from Developmental Lead Exposure in Zebrafish

低浓度铅暴露（0.01-1 ppb）对斑马鱼胚胎神经发育及代谢的影响研究。实验发现铅暴露导致幼虫认知障碍、焦虑样行为及氧化应激增强，同时脂质代谢紊乱（如TG、CE升高，SM、PC降低），提示早期铅暴露通过干扰抗氧化系统和脂质稳态引发神经毒性，且效应低于现有安全阈值。

　　

瓦格纳·安东尼奥·塔马尼奥（Wagner Antonio Tamagno）|克里斯蒂娜·R·费雷拉（Christina R. Ferreira）|袁崇立（Chongli Yuan）|詹妮弗·L·弗里曼（Jennifer L. Freeman）

美国印第安纳州西拉斐特市普渡大学健康科学学院

摘要

在早期发育过程中接触铅（Pb）仍然是一个重大的公共卫生问题，因为目前尚未确定对发育神经毒性的安全阈值。本研究探讨了在环境相关低浓度（0.01、0.1和1 ppb；μg/L）下胚胎接触铅对斑马鱼（Danio rerio）神经发育结果的影响。胚胎在受精后1至72小时内暴露于铅环境中，随后对斑马鱼幼体的认知和行为表现、氧化应激生物标志物、脂质组变化以及一般发育参数进行了评估。暴露于铅的幼体表现出明显的认知障碍和类似抗焦虑的行为，同时涉及复杂神经回路的决策行为也出现了浓度依赖性的紊乱。发育结果还包括自发运动和心率变异性的改变。生化检测显示雌二醇浓度紊乱、抗氧化酶活性调节延迟且不适当，以及氧化应激和脂质过氧化增加。脂质组分析显示，在受精后72小时时三酰甘油（TG）和胆固醇酯（CE）上调，而鞘磷脂（SM）和磷脂酰胆碱（PC）下调。到受精后120小时时，磷脂乙醇胺（PE）、SM和PC持续减少，表明代谢重编程受到延迟。这些结果共同表明，即使是很低的铅浓度也会损害斑马鱼幼体的神经发育过程，改变脂质代谢，并破坏氧化平衡。重要的是，这些发现提供了证据，表明在目前公认的暴露限值以下也存在不良影响，突显了发育中的大脑对铅的高度敏感性，并引发了对暴露人群长期认知和神经发育后果的担忧。

引言

铅（Pb）是一种普遍存在的环境污染物，其对神经系统的毒性作用已有充分记录，尤其是在发育中的生物体内[1]、[2]、[3]、[4]。即使在关键发育窗口期接触低浓度的铅，也可能导致持久的认知和行为缺陷，至今尚未确定安全的暴露阈值[5]。因此，了解在人类相关水平下铅的神经毒性机制对于转化研究和公共卫生至关重要。大多数实验室研究历来都集中在较高的铅浓度上，而与儿童当前暴露水平相对应的较低暴露水平的神经发育效应仍知之甚少，特别是在认知结果和脂质代谢方面。尽管某些地区报告了水中的铅含量，但本研究中使用的浓度是为了模拟人类早期暴露情况，而非环境污染。作为参考，美国疾病控制与预防中心（CDC）目前规定的血液铅参考值（BLRV）为3.5 μg/dL（相当于35 ppb），基于血液水平处于前2.5%的1-5岁儿童[6]。然而，在子宫内暴露会导致胎儿血液中的铅浓度较低，这是由于胎盘转运和吸收动态的作用。因此，在本研究中使用较低的铅浓度来模拟这些早期发育暴露情况。即使在如此低的水平下，铅也与儿童的发展迟缓、学习困难和行为障碍有关[7]、[8]、[9]、[10]，这突显了研究超低剂量下铅的神经毒性机制的必要性。

铅的神经毒性机制已在多种生物系统中得到研究，包括啮齿动物[11]、[12]、[13]、[14]和鱼类[3]、[15]、[16]。这些研究支持了跨物种观察到的不良神经学结果，扩展了研究铅神经毒性机制的生物学模型工具箱。铅神经毒性的一个主要机制是氧化应激，它源于活性氧（ROS）与抗氧化防御之间的失衡[17]、[18]、[19]。铅会干扰酶系统（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶）和非酶系统，耗尽谷胱甘肽（GSH），并破坏关键酶如谷胱甘肽还原酶（GR）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）[20]、[21]、[22]、[23]。GST在解毒和保护神经细胞免受氧化损伤方面起着关键作用。GST基因的遗传多态性进一步调节了对铅的敏感性，将抗氧化防御的变异性与人类的神经发育障碍联系起来[24]、[25]、[26]、[27]。除了氧化还原失衡外，铅还会改变脂质稳态，导致脂质过氧化和膜功能障碍，这些过程与神经递质平衡和大脑发育密切相关[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。这些紊乱可能导致行为障碍，包括多动、类似焦虑的行为和认知缺陷，这些现象在多个物种中都有观察到[35]。铅还会干扰与行为标志物相关的基因表达，为儿童和实验动物模型中观察到的神经行为改变提供了分子层面的见解。例如，先前的研究表明铅会改变与神经元发育相关的基因[36]、[37]，这会干扰斑马鱼幼体的决策行为[38]，并导致记忆[39]、[40]和学习[41]、[42]障碍。

由于监管措施禁止在汽油和油漆中使用铅，过去几十年里许多全球地区的铅环境污染显著减少。尽管这些地区的现代铅暴露仍在发生，但浓度要低得多，并且取决于来源（如土壤、食物、灰尘、水）。人类通常通过摄入受污染的食物或水而暴露于铅。例如，美国的饮用水中铅的含量根据地点和污染源的不同，范围在1至3.88 ppb之间[43]、[44]。大多数研究铅毒性的斑马鱼实验使用的是较高的浓度，通常在5-500 ppb范围内，以诱导可观察到的发育、行为或生化变化[45]、[46]、[47]。然而，环境和转化相关的暴露浓度往往低于这些实验浓度，而这种低剂量暴露的影响仍知之甚少。

鉴于需要进一步了解较低暴露水平下的铅神经毒性，本研究探讨了在受精后1-72小时内胚胎接触铅（0.01、0.1和1 ppb；μg/L；相当于0.001、0.01和0.1 μg/dL）对发育中的斑马鱼的影响。斑马鱼（Danio rerio）因其与人类的遗传相似性、透明的胚胎、保守的抗氧化和代谢系统[48]、[49]、[50]、[51]以及特征明确的行为谱而成为一种特别强大的模型[15]、[53]。重要的是，铅可以穿透斑马鱼的绒毛膜[54]、[55]，这突显了胚胎即使面对微量暴露也具有脆弱性。本研究评估了存活率、孵化率、类似焦虑的行为、认知和决策行为、氧化应激生物标志物、抗氧化酶活性以及脂质组谱。据我们所知，这是首次研究低至0.01 ppb的铅浓度对神经发育毒性的影响，这一浓度低于孕妇血液中检测到的水平[56]，从而为了解铅诱导的神经发育毒性的最早阈值提供了关键见解。

虽然水环境中的铅污染也是一个公认的问题，但本研究的主要目的并非探讨其对水生生物的影响。相反，我们使用斑马鱼作为转化模型，研究在早期发育（1-72小时）接触铅如何影响神经行为结果、氧化应激、内分泌功能和脂质代谢。斑马鱼具有保守的神经发育和分子途径，可以用来研究与人类早期暴露相关的机制。这种方法允许在受控的实验环境中评估机制终点，为人类发育神经毒性的潜在风险提供见解，并补充其他生物转化模型中的研究。

实验设计和暴露方案

成年斑马鱼被饲养在循环系统中（Iwaki Aquatic，美国马萨诸塞州霍利斯顿），温度为28°C，pH值为7.0-7.2，电导率为530-550 μS，溶解氧含量为7.3-8.3 ppm，光照周期为14:10。每天两次评估水质，成年鱼被喂食卤虫（Artemia International LLC., 德克萨斯州费尔维尤）、Golden Pearls 500?800 μm（Artemia International LLC., 德克萨斯州费尔维尤）和Zeigler成年斑马鱼饲料（Zeigler Bros Inc., 宾夕法尼亚州加德纳斯）。为了获得胚胎，...

发育参数

在胚胎发生期间接触铅并未改变存活率（补充图2A）或孵化率（补充图2B）。在受精后24小时时，0.1 ppb铅处理组的鞘磷脂水平高于阴性对照组和其他铅处理组（图1A）。各铅处理组之间的心率有所波动，0.1 ppb铅处理组的心率增加，而1 ppb铅处理组的心率低于阴性对照组（图1B）。

认知测试

进行了认知测试

讨论

在这项研究中，使用发育中的斑马鱼作为转化模型，评估了胚胎在受精后1-72小时内接触铅浓度（远低于人类健康行动水平，即相当于0.1 μg/dL及以下）的影响。分析重点关注行为、生化、脂质和生理变化，以确定是否存在铅暴露的低阈值。在这些低水平下（低至0.01 ppb，相当于0.001...）的发育铅暴露...

结论

本研究表明，即使是在低至0.01 ppb的浓度下，胚胎接触铅也会导致认知障碍、类似焦虑的行为以及显著的生化改变。据我们所知，这是首次研究如此低水平的铅，为定义早期发育暴露的毒理学阈值迈出了关键一步。铅破坏了雌激素平衡，延迟了抗氧化酶的激活，并促进了氧化应激和脂质损伤。

环境影响

重金属铅的发育暴露是全球公共卫生面临的挑战。关于发育神经毒性的更低暴露阈值仍有许多未解之谜。在本研究中，斑马鱼被用作整合脊椎动物模型，以探讨0.01、0.1或1 ppb（μg/L）暴露浓度下的发育毒性。

资金来源

本研究的支持来自美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）、国家神经疾病和中风研究所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke，R01NS130722）以及普渡大学可持续未来研究所（Institute for a Sustainable Future）。

未引用的参考文献

[90]、[96]、[107]

CRediT作者贡献声明

克里斯蒂娜·R·费雷拉（Christina R. Ferreira）：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、软件使用、方法学设计、实验实施。袁崇立（Chongli Yuan）：撰写 – 审稿与编辑、资金筹集。瓦格纳·安东尼奥·塔马尼奥（Wagner Antonio Tamagno）：撰写 – 原始草案编写、数据可视化、验证、软件使用、方法学设计、实验实施、数据分析、概念化。詹妮弗·L·弗里曼（Jennifer L. Freeman）：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源调配、项目管理、方法学设计、实验实施、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：詹妮弗·弗里曼报告称获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）和国家神经疾病与中风研究所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke）的财务支持；詹妮弗·弗里曼还报告获得了普渡大学可持续未来研究所（Purdue University Institute for a Sustainable Future）的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益冲突。