运动神经元区室特异性转录组揭示FUS-ALS中细胞外基质信号受损与细胞周期激酶PLK1激活

《Neurobiology of Disease》：Compartment-specific transcriptome of motorneurons reveals impaired extracellular matrix signaling and activated cell cycle kinase in FUS-ALS

本研究针对FUS-ALS早期轴突退行性变的分子机制尚不明确的问题，研究人员通过微流控技术分离iPSC来源运动神经元的体细胞树突区室与轴突区室，并进行转录组测序分析。结果发现，FUSP525L突变导致轴突区室中PLK1通路、线粒体基因表达和炎症调控相关基因显著上调，而体细胞树突区室中WNT信号和细胞外基质相关功能下调。研究证实PLK1上调是应对DNA损伤的早期事件，其抑制会增加神经元死亡。该研究为理解FUS-ALS的区室特异性病理提供了新视角和潜在靶点。

　　

肌萎缩侧索硬化（ALS）是一种毁灭性的神经退行性疾病，其特征是上下运动神经元的进行性丧失，通常始于远端轴突的去神经支配。其中，由FUS基因（FUsed in Sarcoma）突变引起的FUS-ALS，尤其多见于年轻患者，病情进展迅速。FUS蛋白主要定位于细胞核，参与转录、RNA剪接、DNA损伤应答等多种关键细胞过程。许多致病突变位于其核定位序列（NLS），导致FUS蛋白错误地定位到细胞质，这是FUS-ALS的一个核心病理特征。尽管在理解ALS致病机制方面取得了巨大进展，但FUS突变如何导致早期轴突病变（轴突病），以及体细胞内的分子事件（如DNA损伤）如何与远端轴突的缺陷（如线粒体功能障碍）相联系，仍然是悬而未决的关键问题。传统转录组分析往往忽略了神经元不同区室（如胞体与长距离投射的轴突）内基因表达的局部差异，而这些差异可能对轴突的功能维持和退行性变至关重要。

为了深入探究这一问题，由Vitaly Zimyanin和Banaja P. Dash等人领导的研究团队在《Neurobiology of Disease》上发表了一项研究。他们假设，比较运动神经元体细胞树突区室（SD）和轴突区室的转录组差异，能够揭示驱动FUS-ALS早期轴突退行性变的独特分子路径。研究人员利用具有FUS^P525L点突变的等基因iPSC系，分化成运动神经元（MNs），并结合微流控腔室技术，成功分离并提取了SD和远端轴突区室的RNA，进行了高通量RNA测序（RNA-seq）分析。

研究团队为开展此项研究，主要应用了以下关键技术方法：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建FUS^P525L突变及对照的iPSC系；通过小分子诱导分化方案将iPSC高效分化为运动神经元；使用微流控腔室装置实现运动神经元胞体与轴突的物理分离和独立培养；从分离的区室中提取RNA并进行RNA-seq测序和生物信息学分析（包括差异表达基因分析、GO/KEGG通路富集分析、蛋白互作网络构建、选择性剪接分析等）；通过qPCR、Western blot、免疫荧光染色验证关键分子表达；利用流式细胞术进行细胞周期和细胞凋亡/坏死分析；以及使用PLK1特异性抑制剂BI2536进行功能丧失性研究。

3.1. FUS^P525LMNs have slower axonal growth

研究人员首先证实了所使用的FUS^P525L突变运动神经元模型再现了关键的疾病表型：FUS蛋白从细胞核错误定位到细胞质。更重要的是，他们发现FUS^P525L突变运动神经元的轴突生长能力严重受损。在使用不同通道长度（150μm, 450μm, 900μm）的微流控装置进行轴突生长分析时，突变神经元在穿越较长通道（450μm和900μm）时表现出明显的延迟。特别是在900μm通道中，突变神经元需要比对照多花约10天时间才能达到90%的通道穿越率，且效率更低。这表明FUS突变导致轴突生长能力显著下降，尤其是在需要长距离生长的条件下。

3.2. Compartmentalized RNA-seq of iPSC-derived FUS^WTand FUS^P525LMNs

研究核心在于对体外培养14天（DIV14）的运动神经元进行区室特异性转录组分析。PCA（主成分分析）和相关性分析均清晰地将SD样本与轴突样本区分开来，证明了实验方法能有效分离两个区室的转录组。在FUS^P525L突变条件下，SD区室鉴定出166个差异表达基因（DEGs）（97个上调，69个下调），而轴突区室鉴定出137个DEGs（123个上调，14个下调）。令人惊讶的是，两个区室之间的DEGs重叠极少（仅5个），强烈提示FUS突变在运动神经元的不同区室中引发了截然不同的转录反应。

3.3. Extracellular secretion and extracellular matrix disassembly pathways are important in all distal axonal compartments

对健康对照（FUS^WT）运动神经元的分析显示，轴突区室本身具有独特的转录特征。与SD区室相比，轴突中高表达的基因富集在细胞外基质（ECM）组织、金属蛋白酶激活、炎症反应等通路，而低表达的基因则与DNA/RNA代谢、细胞周期等核相关功能有关。这表明在正常状态下，轴突转录组就偏向于支持其结构完整性（ECM）、局部蛋白水解和环境相互作用的通路。

3.5. Somatodendritic changes upon FUS mutation include WNT signaling, mitochondrial functions and ECM- and synapse-related functions

对SD区室DEGs的功能分析揭示，FUS突变导致SD区室发生显著改变。上调的基因主要与WNT信号通路、GPCR信号以及神经退行性疾病相关通路有关。而下调的基因则富集在神经元发育、突触信号传递、化学突触传递以及ECM结合等功能。蛋白互作（PPI）网络分析进一步确认了WNT信号通路相关基因的上调以及ECM和突触相关基因簇的下调。这些变化与已知的FUS-ALS早期表型，如突触功能障碍和发育通路异常相吻合。

3.6. Functional enrichment and PPI analysis of axon DEGs centre on PLK1 pathway, mitochondrial gene expression and regulation of inflammation

轴突区室的转录组变化尤为引人注目。在FUS^P525L突变轴突中，上调的基因显著富集于PLK1（Polo-like kinase 1）通路、线粒体基因表达/转录、RNA代谢、RIG-I（维甲酸诱导基因I）干扰素信号通路以及微管马达功能。而下调的基因则与ECM和蛋白聚糖结合有关。PPI网络分析清晰地显示出三个主要的功能簇：线粒体基因表达/能量代谢、PLK1相关的细胞周期/DNA损伤修复/细胞骨架组织、以及RIG-I介导的先天免疫反应。这表明FUS突变轴突的核心反应集中在代谢适应、DNA损伤修复机制和炎症信号激活上。

3.7. Alternative splicing analysis and comparison with the FUS CLIP-seq profile reveal affected RNA metabolism and splicing pathways, enrichment of mitochondrial and PLK1/mitotic transcripts

选择性剪接分析发现，轴突区室在FUS突变下发生了远比SD区室广泛的剪接变化（2100个事件 vs 183个事件）。更重要的是，将轴突DEGs与已发表的FUS CLIP-seq（交联免疫沉淀测序）数据进行比较，发现29个轴突DEGs是FUS的直接RNA结合靶标，且这一重叠具有统计学显著性。对这些重叠基因的通路富集分析惊人地发现，它们几乎 exclusively 富集在PLK1通路和DNA复制通路上。这强烈提示，FUS蛋白可能通过直接调控其靶标mRNA（许多是PLK1和细胞周期相关基因）的表达或定位，在轴突中特异性影响这些通路。

3.8. PLK1 expression is upregulated in FUS^P525LMNs

鉴于PLK1在轴突转录组中的突出地位，研究人员对其进行了验证。qPCR和Western blot结果一致表明，在FUS^P525L突变运动神经元中，PLK1的mRNA和蛋白水平均显著上调。免疫荧光染色进一步显示，在分化第14天（DIV14）和第28天（DIV28），FUS突变神经元中呈现高水平PLK1信号的细胞比例显著高于对照。

3.9. PLK1 activity is increased upon upregulation of DNA damage response

由于PLK1已知参与DNA损伤应答，且FUS-ALS运动神经元存在DNA损伤增加，研究人员探讨了二者联系。他们发现，在HEK293细胞和对照运动神经元中，用DNA损伤剂依托泊苷（Etoposide）处理可诱导PLK1上调。然而，在本就高表达PLK1的FUS突变运动神经元中，额外的DNA损伤刺激并未能进一步显著提升PLK1水平，提示其可能已处于某种激活或饱和状态。

3.10. FUS^P525LMNs do not show cell cycle re-entry but are particularly vulnerable against PLK1 inhibition

尽管PLK1是核心细胞周期调节因子，但流式细胞术分析表明，FUS突变并未导致终末分化的运动神经元重新进入细胞周期。那么，PLK1上调的功能意义何在？为了解答这个问题，研究人员使用了PLK1特异性抑制剂BI2536。结果显示，抑制PLK1会显著增加运动神经元的死亡，尤其是FUS^P525L突变神经元对PLK1抑制更为敏感，表现为坏死性细胞死亡显著增加。这表明，在FUS-ALS运动神经元中，PLK1的上调可能是一种代偿性或保护性反应，有助于细胞在应激状态下存活。

综上所述，本研究通过创新的区室特异性转录组学方法，揭示了FUS-ALS运动神经元中此前未被重视的分子图景。研究发现，FUS^P525L突变在体细胞树突区和轴突区引发了截然不同但各自集中的转录紊乱。SD区的变化涉及WNT信号上调和ECM/突触功能下调，而轴突区的反应则核心围绕PLK1通路、线粒体基因表达和先天免疫信号的激活。研究证实PLK1在FUS-ALS运动神经元中表达上调，且这种上调可能与细胞应对DNA损伤有关。更重要的是，功能实验表明PLK1活性对于突变运动神经元的存活至关重要，抑制PLK1会加剧细胞死亡。

该研究的重大意义在于：首先，它提供了首个关于人类FUS-ALS运动神经元区室特异性转录组的详细资源，强调了在神经元不同亚细胞区域存在独特的分子病理机制。其次，它将PLK1通路确立为FUS-ALS轴突病变的一个关键早期事件，将体细胞DNA损伤、轴突线粒体功能异常和细胞存活信号联系起来，为理解疾病早期事件提供了新的框架。第三，发现轴突中PLK1通路激活是一种保护性反应，为思考治疗策略提供了新视角：即调控而非完全抑制该通路可能更有益。最后，研究提示细胞周期相关 machinery 的异常调控可能是ALS中一个比预期更普遍的致病机制。这些发现不仅深化了对FUS-ALS发病机制的理解，也为开发针对特定神经元区室的早期诊断标志物和干预策略指明了新的方向。