《Neurobiology of Disease》：HOPS disruption impairs APP trafficking and processing, promoting exosomal secretion of APP-CTFs
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本研究针对阿尔茨海默病（AD）中淀粉样前体蛋白（APP）代谢紊乱的机制展开探索。研究人员发现，内吞-溶酶体系统关键调控因子HOPS复合体的功能缺失，会破坏APP经VPS35/retromer介导的从内体到高尔基体的逆向运输，导致APP在LAMP1阳性的晚期内体中积累。这些内体含有BACE1但缺乏有活性的γ-分泌酶PSEN2，从而促进了毒性APP C末端片段（APP-CTFs）的生成，并通过外泌体（exosomes）途径分泌。该研究揭示了HOPS功能失调是AD病理中APP代谢异常的新机制，为理解疾病进展提供了新视角。
在大脑的微观世界里，阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）如同一位隐秘的破坏者，其标志性特征——淀粉样斑块，主要由β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集而成。而Aβ的前体，即淀粉样前体蛋白（APP），其正常的细胞内运输和加工过程对维持神经元健康至关重要。APP的代谢旅程高度依赖于一个精细的细胞内膜系统——内吞-溶酶体系统（endo-lysosomal system）。这个系统就像城市的物流网络，负责将蛋白质运送到需要的地方或回收处理站。然而，在AD患者的大脑中，这个“物流系统”很早就出现了故障，表现为内体膨大、溶酶体功能失常等。尽管已知许多AD遗传风险因子参与调控内吞-溶酶体系统，但该系统失调如何具体影响APP处理，进而推动AD病理发展的详细机制，仍是未解之谜。近期，一项发表在《Neurobiology of Disease》上的研究将目光投向了一个内吞-溶酶体系统的“总调度员”——HOPS复合体。
HOPS复合体是一个由六个亚基（VPS11, VPS16, VPS18, VPS33a, VPS39, VPS41）组成的核心调控复合物，主要负责介导内体与溶酶体等细胞器的融合，确保“货物”能够准确送达并降解。有趣的是，编码HOPS亚基的基因突变会导致严重的神经发育性疾病，并且在AD患者脑组织中，某些HOPS组分（如VPS18和VPS41）的表达水平有所下降。这些线索暗示HOPS功能失调可能与AD存在关联，但HOPS是否以及如何直接影响APP的运输和加工，尚不清楚。为了解开这个谜团，由Derk Draper等领导的研究团队开展了一项深入的研究。
研究人员综合运用了细胞生物学、分子生物学和成像技术等多种手段。他们利用基因敲除（Knockout, KO）技术，在人类HeLa细胞中构建了单个HOPS亚基（VPS18, VPS39, VPS41）缺失的细胞系。为了研究APP的运输动力学，他们采用了同步化运输追踪系统（RUSH系统）。在神经元研究中，为了避免直接敲除HOPS导致的细胞毒性，他们巧妙地利用了SARS-CoV-2病毒的ORF3a蛋白，该蛋白能通过结合VPS39亚基来特异性干扰HOPS复合体的功能。研究还涉及免疫荧光染色、共聚焦显微镜、免疫电子显微镜（immuno-EM）来观察蛋白质的定位和细胞器形态。通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）分析APP及其切割产物的水平，并使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测Aβ42。此外，通过超速离心和尺寸排阻色谱分离细胞外囊泡（EVs），并利用TIRF显微镜实时观察囊泡的分泌过程。实验模型包括HeLa细胞系和原代培养的大鼠海马及皮层神经元。
2.1. HOPS缺失将APP从高尔基体重新分布到内体
研究人员首先在HOPS功能受损的HeLa细胞中表达荧光标记的APP。他们发现，与野生型（WT）细胞中APP主要分布在核周高尔基区和小管状结构不同，HOPS缺失导致APP从高尔基区域显著减少，并累积在细胞质中散在的膨大囊泡结构中。免疫电镜结果进一步证实，在WT细胞中，APP富集于反面高尔基网（TGN），而在HOPS缺失细胞中，APP则主要存在于富含腔内囊泡（ILVs）的膨大内体中。
2.2. HOPS缺失诱导APP在晚期内体中积累
通过共定位分析，研究人员确定这些积累APP的囊泡是LAMP1阳性、能够被LysoTracker标记（表明腔内酸化）、但缺乏活性组织蛋白酶B和D的晚期内体。值得注意的是，这些APP阳性的内体与之前报道的、同时含有早期内体标记EEA1和晚期内体标记的“HOPS小体”重叠有限，表明APP主要累积在了一个独特的晚期内体群体中。
2.3. HOPS功能损害 disrupts APP从内体到TGN的回收
为了区分APP在高尔基区域减少是由于分泌途径受阻还是回收途径受损，研究人员使用了RUSH系统来同步化追踪新合成APP的运输。结果表明，APP从内质网释放后到达和高尔基体的动力学在WT和VPS41 KO细胞中没有差异，说明HOPS缺失不影响APP从TGN的运出。然而，释放8小时后，HOPS缺失细胞中高尔基区域的APP信号显著降低，而APP在酸化内体（LysoTracker阳性）中的共定位显著增加。这表明HOPS的缺失特异性地损害了APP从内体返回TGN的回收过程。
2.4. HOPS缺失阻止APP被招募到VPS35回收小管中
APP的回收依赖于retromer复合体（其核心组分是VPS35）。免疫电镜显示，在WT细胞中，APP存在于从内体出芽的VPS35阳性回收小管中；然而，在HOPS缺失细胞中，虽然VPS35阳性小管仍然形成，但其内却缺乏APP。免疫荧光共定位分析也证实，HOPS缺失显著降低了APP与VPS35及其相互作用蛋白SNX1的共定位。这些结果从形态学和生化水平证明，HOPS缺失导致APP无法进入retromer介导的回收途径。
2.5. HOPS缺失增加APP和BACE1的共定位并诱导APP-CTF积累
既然APP被困在晚期内体中，而内体是APP被β-分泌酶（BACE1）切割产生APP C末端片段（CTFs）的主要场所。研究人员发现，HOPS缺失增加了APP与BACE1在晚期内体中的共定位。蛋白质印迹分析显示，HOPS缺失细胞中全长APP（flAPP）水平略有增加，而APP-CTFs（包括淀粉样源性的C99片段）则显著积累。使用双标签（N端和C端分别标记）的APP构建体进行成像分析，也观察到HOPS缺失细胞中APP加工增加的现象。通过比较野生型APP和具有保护性突变（A673T, APPice，能减少淀粉样源性加工）的APP处理，发现HOPS缺失导致了淀粉样源性和非淀粉样源性CTFs的共同积累。
2.6. HOPS disruption诱导APP在大鼠海马神经元树突区域内体中的积累
为了在更接近生理条件的模型中验证发现，研究者在原代大鼠海马神经元中通过表达ORF3a来干扰HOPS功能。结果显示，HOPS disruption同样导致内源性APP从高尔基区域丢失，并在囊泡中积累。更重要的是，在神经元这种高度极化的细胞中，HOPS disruption导致APP在胞体和树突区域（somatodendritic domain）的LAMP1阳性内体中特异性积累，这些囊泡变得静止不动，而在正常神经元中，APP阳性囊泡是移动的。这改变了APP在神经元中的正常分布极性。
2.7. HOPS disruption在神经元中增加APP-CTF水平但不增加Aβ42产生
在神经元中，HOPS disruption同样导致了APP-CTFs的积累。然而，令人意外的是，ELISA检测并未发现Aβ42水平的增加。进一步研究发现，HOPS disruption虽然增加了APP-CTFs与晚期内体标记LAMP1的共定位，但却阻碍了APP-CTFs与位于溶酶体中的γ-分泌酶组分PSEN2的共定位。这表明，HOPS功能缺失虽然促进了CTFs的生成，但由于其阻碍了内体-溶酶体融合，使得CTFs无法被PSEN2进一步加工产生Aβ。
2.8. HOPS impairment增加sAPP和含有APP-CTFs的细胞外囊泡的分泌
由于HOPS缺失阻碍了晚期内体与溶酶体的融合，研究人员推测这可能转而促进晚期内体与细胞膜融合，从而分泌其内容物。他们从细胞培养上清中分离了细胞外囊泡（EVs）。蛋白质印迹分析表明，HOPS缺失细胞的EVs中，APP-CTFs（而非flAPP）的含量显著增加，尤其是在VPS41 KO细胞中。同时，可溶性APP（sAPP）的分泌也增加了。利用TIRF显微镜，研究人员实时观察到了含有APP和晚期内体标记CD63的囊泡与细胞膜融合并释放内容物的过程。
该研究的结论部分对上述发现进行了整合与深化。研究确立了一条新的致病通路：HOPS功能丧失→ APP通过retromer从内体到TGN的回收受阻→ APP在晚期内体中积累→ APP与错误定位的BACE1相遇导致CTFs生成增加→ 由于内体-溶酶体融合缺陷，CTFs无法被降解或进一步加工为Aβ→ 累积的CTFs通过外泌体形式被分泌到细胞外。
这项研究的意义重大。首先，它首次在分子和细胞水平上清晰地揭示了HOPS复合体功能失调如何通过干扰APP的正常运输而导致其毒性代谢产物积累，为理解某些神经退行性疾病以及AD中内吞-溶酶体系统早期病变提供了机制性解释。其次，研究发现了APP-CTFs通过外泌体分泌这一新的病理现象，这为AD病理在脑内可能的“传播”机制提供了新的思路，因为含有毒性蛋白的EVs可以被邻近细胞摄取，从而扩大损害范围。最后，HOPS复合体作为一个潜在的治疗靶点被凸显出来。未来研究可以探索通过增强HOPS功能来纠正APP代谢紊乱，从而为开发延缓AD进展的新策略开辟道路。
