《Frontiers in Microbiology》：The developmental changes of fecal microbial composition and diversity in emu (Dromaius novaehallandiae) at early growth stages
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本综述系统阐述了鸸鹋(Dromaius novaehollandiae)出生后7至28天关键发育阶段粪便微生物群的演替规律。通过16S rRNA基因测序技术，研究发现优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，其群落结构、α/β多样性及PICRUSt预测功能均呈现显著的年龄特异性变化。该研究为平胸类鸟类的微生物生态学研究提供了重要理论依据，对优化鸸鹋营养管理和健康策略具有指导意义。
引言
肠道微生物群包含细菌、古菌、真核微生物和病毒等多种微生物。在家养动物中，动态的肠道微生物群落通过影响宿主的营养代谢、肠道健康、免疫调节和病原体抗性，在维持鸟类生长和健康方面发挥关键作用。微生物定植从孵化开始，并在早期发育过程中经历动态演替，此时鸟类易受各种应激源和疾病的影响，从而影响其健康和生存结果。了解动物肠道微生物群的动态和调控机制可以增强对其健康和生存的见解，从而为保护和育种工作提供有价值的指导。随着下一代测序技术的发展，针对16S核糖体RNA基因的扩增子测序仍然是研究家禽微生物群落的主要方法。尽管越来越多的研究进展揭示了家养禽类物种和鸵鸟等长寿鸟类中宿主特异的微生物特征，但幼年鸸鹋粪便微生物群组装如何与年龄特异性生理需求相关仍 largely unknown。
鸸鹋是原产于澳大利亚的最大不会飞的鸟类，目前因其油、肉、蛋和皮革的生产而具有经济意义，在全球范围内被养殖。鸸鹋养殖最近在经济上变得重要，在亚洲国家如中国和印度的新兴经济体中日益扩张的记录。先前的研究已将鸸鹋的生长过程描述为优化鸸鹋产业饲养和管理制度的宝贵策略。为了提高效率，优化了鉴定程序以加速处理同时保持诊断精度。因此，鸸鹋提供了一个研究年龄依赖性微生物演替的理想模型。鉴于其晚成性发育、长寿和孵化后显著的增长需求，微生物组组装和组成可能在整个漫长的发育窗口期决定生理结果。先前的研究已经显示了成年鸸鹋小肠不同段（十二指肠、空肠和回肠）以及盲肠中的系统发育微生物多样性和代谢功能。由于鸸鹋通常在大约1.5年时成熟，寿命为5到10年，它们作为早成雏鸟经历快速的饮食转变和环境暴露。然而，据我们所知，很少有纵向研究量化其早期生长第一个月期间的粪便微生物群动态，此时它们的微生物群落可能不稳定且高度可变。
当破坏性采样不是主要选择时，粪便是描述动物肠道微生物群的理想采样来源，并且具有从特定鸟类随时间收集一系列样本的巨大优势。因此，本研究旨在调查新生儿鸸鹋在早期发育阶段粪便微生物群如何随年龄变化。在这里，我们使用16S rRNA基因测序描述了孵化后7至28天鸸鹋雏鸟粪便中主要微生物群落的分类分辨率，旨在为优化全球受威胁平胸类鸟类的管理方案提供一个框架。
材料与方法
实验方案由佛山大学动物护理和使用委员会审查并批准。所有程序均按照相关指南和规定进行。
总共8只一日龄健康鸸鹋由商业农场提供。在引入鸸鹋雏鸟前1周使用高锰酸钾和福尔马林对动物房舍进行消毒。鸸鹋饲养在环境控制的房舍中，恒定温度为28–30°C，相对湿度为60–70%。热灯在第一天悬挂在离地面50–60厘米高处，然后根据年龄逐渐增加高度。鸸鹋饲喂普通全价日粮和新鲜王草粗饲料（切成1–2厘米长度），比例为1:1。所有鸟类在整个实验期间自由采食和饮水。新鲜粪便分别在每只鸸鹋7、14、21和28日龄早晨收集，立即在液氮中冷冻，随后在?80°C储存直至16S rRNA基因测序分析。基于纵向研究的可用性和可行性，当前研究中粪便样本样本量作为评估肠道微生物群落动态的非侵入性代理。
从鸸鹋粪便样本中分离微生物DNA。使用特异性引物扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区。构建的文库在Illumina HiSeq 2,500系统上进行质量评估和双末端测序。随后的生物信息学处理使用QIIME软件包进行定量微生物生态学评估。通过以97%相似性阈值聚类序列来划定操作分类单元。使用taxa插件推导出门、纲、目和属分类中前10名细菌类群的相对丰度。通过观察物种数、香农指数、辛普森指数、Chao1指数、ACE指数和PD_whole_tree指数等指标量化α多样性。使用非度量多维尺度分析、UPGMA聚类、相似性分析和β多样性指数评估处理对微生物群落结构的影响。使用线性判别分析效应大小方法和T检验统计比较处理间微生物群的差异丰度。本研究呈现的数据集可在NCBI Bioproject存储库中找到。
使用单因素方差分析，然后进行Duncan多重比较检验进行事后分析。数据以平均值±标准误表示。p < 0.05被认为具有统计学显著性。
结果
等级丰度分析和稀疏曲线分析表明测序深度足够，曲线接近饱和，确认了所有实验组细菌多样性的全面覆盖。维恩图进一步确定了鸸鹋粪便中四个处理共有的589个操作分类单元，在d 7、14、21和28分别有55、96、771和265个独特OTU。这些发现共同表明足够的测序深度捕获了鸸鹋粪便样本中存在的主要微生物多样性。
前10名优势细菌在门、目、科和属水平的丰度如图所示。具体而言，前10名优势门包括厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、Melainabacteria、梭杆菌门、Oxyphotobacteria、unidentified_Bacteria、绿弯菌门和酸杆菌门。在目水平，前10名优势目为丹毒丝菌目、乳杆菌目、肠杆菌目、拟杆菌目、棒杆菌目、梭菌目、微球菌目、芽孢杆菌目、脱硫弧菌目和假单胞菌目。此外，在科水平，丹毒丝菌科、肠球菌科、肠杆菌科、拟杆菌科、棒杆菌科、unidentified Clostridiales、毛螺菌科、微球菌科、葡萄球菌科和Muribaculaceae被确定为前10名科。而且，前10名优势属包括Turicibacter、肠球菌、unidentified_Enterobacteriaceae、拟杆菌、unidentified_Corynebacteriaceae、unidentified_Clostridiales、葡萄球菌、脱硫弧菌、Romboutsia和链球菌。
鸸鹋粪便在不同日龄的肠道微生物α多样性如图所示。d 21时鸸鹋粪便的观察物种数、香农指数和PD whole tree指数高于其他组。而且，与d 7相比，d 21和28时鸸鹋粪便的Chao 1和ACE指数显著增加。UPGMA和NMDS分析揭示了鸸鹋粪便中不同日龄微生物群落的明显差异。而且，d 14和21时鸸鹋粪便微生物群的β多样性指数显著高于d 7和28。此外，相似性分析显示，鸸鹋粪便的微生物群落结构在d 14组和d 7组之间、d 21组和d 7组之间以及d 14组和d 28组之间存在显著差异。
通过进一步的LEfSe和T检验分析比较处理间分类单元丰度的差异。在鸸鹋粪便中不同日龄间鉴定出26个判别性生物标志物。具体而言，5个细菌分类单元包括g_Turicibacter、c_Erysipelotrichia、f_Erysipelotrichaceae、o_Erysipelotrichales和p_Firmicutes在d 7时在鸸鹋粪便中显著富集。此外，p_Actinobacteria、c_unidentified_Actinobacteria、o_Corynebacteriales、f_Corynebacteriaceae、g_unidentified_Corynebacteriaceae和s_Corynebacterium_stationis在d 28时在鸸鹋粪便中丰富。有10个细菌分类单元包括p_Bacteroidetes、c_Bacteroidia、o_Bacteroidales、f_Bacteroidaceae、g_Bacteroides、s_Bacteroides_acidifaciens、f_Lachnospiraceae、g_Staphylococcus和s_Bacteroides_sartorii在d 21时在鸸鹋粪便中富集。而且，c_Bacilli、o_Lactobacillales、f_Enterococcaceae、g_Enterococcus、s_Enterococcus_durans和o_Micrococcales在d 14时在鸸鹋粪便中丰富。LEfSe的进化分支图显示富集的微生物生物标志物主要属于三个门，包括厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。
而且，T检验显示的差异富集细菌如图所示。在门水平，与d 7相比，d 21时鸸鹋粪便中厚壁菌门的相对丰度降低，而放线菌门的相对丰度增加。此外，与d 28相比，d 7时鸸鹋粪便中拟杆菌门的相对丰度降低。在属水平，与d 14和21相比，d 7和28时鸸鹋粪便中Turicibacter的相对丰度显著增加，而与d 7或d 14相比，d 28时拟杆菌、乳酸杆菌、Jeotgalicoccus和Globicatella的相对丰度增加。而且，与d 14组相比，d 21时鸸鹋粪便中Unidentified_Corynebacteriaceae、短杆菌和Jeotgalicoccus的相对丰度均增加。这些结果共同表明，在鸸鹋不同生长阶段发挥重要作用的微生物群落是不同的。
对d 7、14、21和28日龄鸸鹋的粪便微生物群进行PICRUST功能预测分析，以更好地了解微生物群落在宿主中的作用。不同日龄鸸鹋的KEGG Level 3代谢途径存在显著差异。结果表明，与其他组相比，7日龄鸸鹋的粪便微生物具有高水平的代谢途径，包括氨基糖和核苷酸糖代谢、甲烷代谢、分泌系统、果糖和甘露糖代谢、氧化磷酸化、双组分系统、淀粉和蔗糖代谢、磷酸戊糖途径、磷酸转移酶系统、转录因子、转运蛋白、糖酵解或糖异生以及丙酮酸代谢。而且，与d 21和28相比，氧化磷酸化以及精氨酸和脯氨酸代谢途径在14日龄鸸鹋中富集。对于21日龄鸸鹋，与7日龄鸸鹋相比，ABC转运蛋白、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、其他离子耦合转运蛋白和染色体途径显著增加。此外，与
