《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：HLF and hTERT cooperatively enable partial immortalization of human hematopoietic stem and progenitor cells
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本研究首次报道了HLF（肝白血病因子）与hTERT（人端粒酶逆转录酶）通过BaEV（狒狒内源性病毒）假型慢病毒转导协同实现人造血干细胞和祖细胞（HSPCs）部分永生化。该模型在优化培养条件下维持CD34+CD90+细胞长达70天，并保留向红系（CD235a+）、巨核系（CD61+/CD41+）和巨噬细胞（CD14+）分化能力，为基因治疗构建体测试提供了类原代细胞平台。
1 引言
造血干细胞和祖细胞（HSPCs）作为造血系统的顶端细胞，在血液疾病治疗和基因疗法开发中具有核心价值。然而原代HSPCs的稀缺性严重限制了临床前研究。虽然诱导多能干细胞（iPSCs）分化和小分子化合物扩增方案已有探索，但均无法实现HSPCs的长期稳定维持。近年研究发现肝白血病因子（HLF）和混合系白血病易位至3（MLLT3）是调控原始HSPCs干性的关键转录因子，而人端粒酶逆转录酶（hTERT）可延缓细胞衰老。本研究通过组合基因过表达策略，首次尝试建立部分永生化的HSPCs模型。
2 材料与方法
2.1 CD34+HSPCs分离与培养
从粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员的外周血（mPB）中通过淋巴细胞分离液梯度离心获取外周血单核细胞（PBMNCs），采用CD34+筛选试剂盒分选目标细胞。实验对比了AC培养基（含SCF、Flt3-L、TPO、IL-6及RUS小分子组合）和冬眠培养基（含SCF、IL-11、L-谷氨酰胺及2-巯基乙醇）对CD90+细胞亚群的维持效果。
2.2 慢病毒载体构建与转导优化
设计三种慢病毒载体：单独表达hTERT的EF1A启动载体、hTERT+HLF及hTERT+MLLT3的双基因诱导系统（MND启动子驱动hTERT与Tet-On，TRE3G启动子调控HLF/MLLT3）。通过比较VSV-G和BaEV两种病毒包膜，发现BaEV在CD90+HSCs中转导效率显著优于VSV-G。联合使用Retronectin涂层、Polybrene和Cyclosporin H可将转导效率提升3.4倍。
2.3 功能验证体系
通过集落形成单位（CFU）实验评估细胞多向分化潜能，并建立红系（三阶段诱导法）、巨噬细胞（GM-CSF/M-CSF诱导）和巨核细胞（Megakaryocyte Expansion Supplement诱导）定向分化方案，通过流式细胞术检测CD235a+网织红细胞、CD14+巨噬细胞和CD61+/CD41+巨核细胞标志物。
3 结果
3.1 条件性永生化系统验证
doxycycline（Dox）诱导浓度测试表明0.25-1 μg/mL对HSPCs亚群无毒性影响。qPCR证实转导后hTERT、HLF和MLLT3 mRNA表达显著上调，且荧光报告基因（GFP/mCherry）表达率达32.1%-45.7%。
3.2 培养体系与转导策略优化
冬眠培养基添加10%标准AC细胞因子可最佳维持CD34+CD90+CD49f+原始细胞比例，21天后仍保留集落形成能力。BaEV包膜联合转导增强剂使mCherry+细胞比例在hTERT+HLF组达5.72%，显著高于hTERT+MLLT3组（0.92%）。
3.3 部分永生化表型验证
hTERT+HLF转导的mCherry+细胞在分选后持续增殖70天，保持圆形干细胞形态；而hTERT+MLLT3组出现分化或凋亡。第40天CFU实验显示永生化细胞仍能生成粒-单核系（CFU-GM）、红系（BFU-E/CFU-E）及混合集落（CFU-GEMM），但数量低于野生型HSPCs。定向分化实验证实其可产生CD235a+网织红细胞（2.5%）、CD14+巨噬细胞（35.2%）和CD61+/CD41+巨核细胞（12.8%），但祖细胞扩增倍数显著降低。
4 讨论
HLF通过激活干性相关转录程序，与hTERT协同克服HSPCs体外增殖障碍。相较于MLLT3的染色质调控功能，HLF在维持自我更新方面表现更优。虽然永生化细胞呈现髓系分化偏倚且扩增能力有限，但其多向分化潜力为镰刀细胞病（SCD）、β-地中海贫血等血液疾病基因治疗提供了可扩展的测试平台。未来可结合HOXB4、MEIS1等因子或模拟生态位的小分子化合物进一步优化系统。
5 结论
hTERT与HLF协同表达可实现人CD90+HSCs部分永生化，在70天内维持增殖能力与多系分化潜力。该模型突破了原代HSPCs的应用瓶颈，为血液疾病基因治疗构建体验证、药物筛选及疾病建模提供了可再生细胞资源。
