《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Fenofibrate suppresses Mycoplasma bovis infection via autophagy-mediated cholesterol regulation in bovine mammary epithelial cells and murine mammary tissue
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本研究揭示了PPARα激动剂非诺贝特（Fenofibrate）通过激活自噬（Autophagy）关键转录因子TFEB/TFE3，调控胆固醇代谢关键基因（如HMGCR、SREBF2、ACAT1），从而抑制牛支原体（Mycoplasma bovis）在牛乳腺上皮细胞（bMECs）及小鼠乳腺组织中的感染，为治疗牛支原体乳腺炎提供了新的宿主导向治疗（Host-Directed Therapy, HDT）策略。
非诺贝特通过自噬介导的胆固醇调控抑制牛支原体感染
背景
牛支原体（Mycoplasma bovis）是引起牛慢性呼吸道疾病、乳腺炎、关节炎和中耳炎的重要病原菌，给全球畜牧业造成重大经济损失。由于牛支原体缺乏细胞壁，对靶向细胞壁合成的抗生素（如青霉素类和头孢菌素类）具有天然耐药性。更关键的是，其富含胆固醇的质膜和自身无法合成胆固醇的特性，使其完全依赖宿主来源的固醇来维持膜完整性和支持细胞内增殖。因此，宿主胆固醇代谢成为一个有前景的治疗干预靶点。
细胞侵袭是病原菌建立持续性感染和逃避免疫清除的关键策略。牛支原体作为一种兼性细胞内病原体，能够侵入和定植宿主细胞，这与其持续感染密切相关。随着抗菌素耐药性的增加和有效疫苗的缺乏，迫切需要开发靶向宿主-病原体相互作用而非病原体本身的新方法。新兴研究强调了两个影响牛支原体感染的关键宿主细胞过程：胆固醇代谢和自噬（Autophagy）。自噬是真核细胞抵御细胞内病原体的基本防御机制，并在维持脂质稳态中发挥关键作用。值得注意的是，短期胆固醇耗竭会触发自噬的快速激活。转录因子EB（TFEB）和转录因子E3（TFE3）是溶酶体生物发生和自噬流（Autophagic Flux）的主要调节因子。
非诺贝特（Fenofibrate）是过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）的激动剂，广泛用于治疗高甘油三酯血症和混合性血脂异常。此外，据报道它还能诱导自噬，并在多种疾病模型中发挥有益作用。鉴于其在脂质调节和免疫调节方面的双重作用，以及良好的安全性和广泛的临床应用，非诺贝特具有治疗牛支原体诱导的乳腺炎的潜力。
材料与方法
本研究使用了体外牛乳腺上皮细胞（bMECs）和体内小鼠乳腺模型，探讨非诺贝特通过自噬-胆固醇轴调节牛支原体感染和细胞内复制的治疗潜力。使用牛支原体标准株PG45和野生株WT21进行感染。通过蛋白质印迹（Western Blot）、实时荧光定量PCR（qPCR）、共聚焦激光显微镜、菌落形成单位（CFU）测定、组织病理学分析和酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，评估了非诺贝特对自噬、TFEB/TFE3核转位、胆固醇代谢、细菌定位、炎症反应和细菌负荷的影响。
结果
非诺贝特以浓度和时间依赖性方式调节bMECs中的自噬
蛋白质印迹分析用于优化非诺贝特在bMECs中诱导自噬的浓度和处理时间。用50 μM非诺贝特处理9小时，能显著上调溶酶体膜相关蛋白LAMP2和溶酶体运输成熟蛋白RAB7A的表达。同时，自噬小体相关标志物LC3B和自噬受体蛋白SQSTM1的表达也呈时间依赖性增加。因此，选择50 μM处理9小时作为非诺贝特诱导bMECs自噬的条件。
非诺贝特增强牛支原体感染的bMECs中的自噬活性并恢复自噬流
在牛支原体感染组中，非诺贝特显著上调了溶酶体膜蛋白LAMP2和自噬标志物LC3B的表达，但下调了溶酶体运输蛋白RAB7A和自噬受体SQSTM1。SQSTM1的减少是自噬流完整性的关键指标。通过转染mCherry-GFP-LC3B的共聚焦显微镜观察进一步证实，非诺贝特处理增加了红色斑点（自噬溶酶体）和黄色斑点（自噬小体）的数量，即使在牛支原体感染下也增强了自噬流，表明其能够恢复感染导致的自噬流受损。
非诺贝特促进TFEB和TFE3核转位以调节bMECs在牛支原体感染期间的自噬反应
为探究非诺贝特调节自噬的机制，研究了自噬和溶酶体生物发生的关键转录调节因子TFEB和TFE3的表达和亚细胞定位。非诺贝特促进了TFEB和TFE3的核积累，而牛支原体感染导致它们主要滞留于细胞质。共聚焦成像结果与此一致，非诺贝特暴露后TFEB和TFE3的核内荧光强度增加。这表明非诺贝特通过促进TFEB和TFE3核转位，上调自噬和溶酶体相关基因的转录，从而增强bMECs的自噬活性。
非诺贝特调节牛支原体感染期间的胆固醇生成
评估了非诺贝特对细胞内游离胆固醇和总胆固醇浓度，以及胆固醇调节基因（ACAT1、HMGCR、SREBF2）表达的影响。感染升高了细胞内游离胆固醇浓度，而非诺贝特降低了感染组的总胆固醇和游离胆固醇。值得注意的是，非诺贝特上调了参与游离胆固醇酯化的基因ACAT1的转录，同时下调了胆固醇生物合成的限速酶HMGCR及其上游转录激活因子SREBF2的表达。同时，非诺贝特降低了细胞内两种牛支原体菌株的菌落形成单位（CFU）。因此，非诺贝特在牛支原体感染期间调节胆固醇浓度和相关基因转录，从而减轻细胞内细菌负荷。
非诺贝特调节牛支原体感染期间胆固醇与自噬标志物LC3的共定位
细胞内胆固醇浓度的改变可以抑制自噬溶酶体的成熟。本研究使用Filipin染色可视化细胞内游离胆固醇，用红色荧光标记牛支原体，并通过GFP-LC3腺病毒转染监测自噬标志物LC3。共聚焦激光显微镜评估胆固醇、牛支原体和LC3三者之间的共定位发现，牛支原体感染降低了自噬小体（绿色）与牛支原体（红色）的共定位（黄色斑点减少），同时增加了牛支原体与游离胆固醇的共定位（粉色斑点增强）。非诺贝特处理减少了牛支原体-胆固醇的共定位（粉色斑点减少），并恢复了自噬小体-牛支原体的共定位（黄色斑点增加），从而限制了细菌获取宿主游离胆固醇，抑制了牛支原体的细胞内复制。
非诺贝特调节牛支原体感染期间小鼠乳腺组织中自噬和溶酶体相关蛋白的表达
为了评估非诺贝特对抗牛支原体感染的体内疗效，建立了Balb/C小鼠乳腺炎模型。乳腺组织的免疫组织化学分析表明，与对照组相比，牛支原体PG45和WT21菌株感染并未显著改变自噬标志物LC3B的表达，表明没有明显的自噬。值得注意的是，非诺贝特处理恢复了感染组中LC3B的表达，并减少了SQSTM1的积累，表明自噬流被重新激活。此外，牛支原体感染后溶酶体膜蛋白LAMP1和LAMP2的表达降低，而非诺贝特处理上调了这两种蛋白的表达。
非诺贝特通过调节胆固醇稳态减轻牛支原体诱导的乳腺组织损伤和细胞内细菌负荷
使用Amplex?胆固醇检测试剂盒评估非诺贝特治疗对牛支原体感染期间乳腺组织胆固醇的影响。感染后48小时，乳腺腺体中的总胆固醇和游离胆固醇浓度显著升高。腹腔注射非诺贝特（100 mg/kg）36小时，降低了感染组织中的总胆固醇和游离胆固醇浓度。组织病理学评估显示，感染后48小时，乳腺腺泡腔内有明显的炎性细胞浸润，包括中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞，以及脱落的推测正在坏死的上皮细胞。相比之下，非诺贝特治疗的小鼠乳腺腺体结构完整，炎性细胞浸润可忽略不计。
为了量化细菌负荷，从乳腺组织中分离牛支原体并计数菌落形成单位（CFU）。非诺贝特显著降低了乳腺内牛支原体负荷，并降低了乳腺中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及抗炎细胞因子IL-10的表达。
讨论
本研究证明，PPARα激动剂非诺贝特通过恢复自噬流和重编程宿主胆固醇代谢，有效对抗牛支原体感染。
非诺贝特以时间和浓度依赖的方式诱导bMECs自噬，最佳处理条件为50 μM处理9小时。牛支原体感染未能增强bMECs的自噬流，并伴有自噬受体SQSTM1的积累，这是自噬降解受损的标志。非诺贝特处理显著逆转了这些改变，增加了LAMP2和LC3B的表达，同时显著降低了SQSTM1。共聚焦显微镜证实非诺贝特增强了自噬小体-溶酶体融合并激活了自噬流。因此，非诺贝特通过缓解牛支原体诱导的自噬流阻断来恢复受损的自噬。
非诺贝特显著促进了TFEB和TFE3的核转位，而牛支原体感染导致其滞留于细胞质。这表明非诺贝特通过调节TFEB和TFE3的活性，作用于自噬相关基因表达的上游。
牛支原体感染显著提高了bMECs中的细胞内游离胆固醇浓度，这可能有利于牛支原体的膜完整性和细胞内复制。非诺贝特显著降低了总胆固醇和游离胆固醇浓度，同时改变了胆固醇代谢相关基因的转录谱，即上调ACAT1，下调HMGCR和SREBF2。这些转录变化伴随着细胞内牛支原体负荷的大幅下降。共聚焦显微镜显示，非诺贝特处理后，病原体与游离胆固醇的共定位减少，同时其与自噬小体的关联增加。因此，非诺贝特介导的胆固醇重新分布可能促进了牛支原体的自噬清除。
非诺贝特的保护功效在小鼠乳腺炎模型中得到进一步证实。非诺贝特显著减少了乳腺组织中的炎性细胞浸润，保持了乳腺腺泡的结构完整性，并抑制了促炎和抗炎细胞因子的表达。与体外研究结果一致，非诺贝特恢复了感染乳腺组织中自噬和溶酶体相关标志物LC3B和LAMP1/2的表达，并促进了SQSTM1的降解。此外，非诺贝特显著降低了乳腺组织内的胆固醇积聚和牛支原体CFU。
非诺贝特的代谢调节作用不仅可通过其经典靶点PPARα介导，还可通过激活AMPK通路等方式实现，这种多靶点机制降低了快速产生耐药性的风险。尽管本研究强有力地表明非诺贝特通过自噬介导的胆固醇调节对牛支原体感染发挥保护作用，但仍存在一些局限性，需要进一步验证其作用机制、对乳腺生理功能的潜在影响，并在牛原代免疫细胞系统和体内模型中进行更多验证。
结论
本研究结果表明，非诺贝特通过恢复自噬和调节细胞内胆固醇稳态，有效抑制了牛支原体感染。在bMECs中，非诺贝特增强了自噬和溶酶体活性，促进了TFEB和TFE3的核转位，并挽救了牛支原体损害的自噬流。它还通过调节关键胆固醇相关基因，减少胆固醇积聚和细菌负荷。这些效应在体内小鼠乳腺炎模型中得到证实，非诺贝特减轻了组织炎症，使自噬-溶酶体功能正常化，并显著降低了病原体负荷。这项研究强调了非诺贝特作为一种通过调节自噬和脂质代谢来有效治疗细胞内牛支原体感染的有前景的治疗策略。
