《Frontiers in Nutrition》：Hyperoside ameliorates NAFLD in rats via remodeling gut microbiota and reprogramming serum metabolic networks
引言
非酒精性脂肪肝病（NAFLD）已成为导致肝硬化、肝细胞癌及终末期肝病的主要原因之一。其组织学谱系从单纯性脂肪变性可进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），并可能进一步发展为肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。NAFLD的发病机制涉及胰岛素抵抗、脂代谢紊乱、线粒体功能障碍和慢性低度炎症等多种相互关联的机制，然而目前尚无获批用于临床的特异性药物治疗方案。现有管理策略主要依赖生活方式干预，但其疗效有限且长期依从性较差。因此，研究能够进行多靶点调控的天然生物活性化合物，为NAFLD的预防和治疗提供了一条充满希望的策略。
近年来，肠道菌群与宿主的相互作用在NAFLD发病机制和进展中受到越来越多的关注。高脂高糖饮食会破坏肠道菌群和屏障功能，促进脂多糖（LPS）等毒素的全身易位。这些微生物成分激活肝脏库普弗细胞和星状细胞，引发与纤维化相关的炎症反应。此外，肠道菌群产生的代谢物，如短链脂肪酸（SCFAs）、胆汁酸和氧化三甲胺（TMAO），在调节宿主能量稳态和代谢平衡中起着至关重要的作用。这些结果表明，调节肠道微生物组可能成为NAFLD的一种有前景的治疗方法。
在此背景下，以“多成分、多靶点、多途径”整体观为特点的中药复方在治疗代谢性疾病方面显示出独特优势。护肝清脂方是一种临床用于肝脏疾病的中药处方，其包含山楂、荷叶、丹参、茵陈蒿等多种草药成分，传统上用于保肝利胆、健脾、活血化瘀、清热利湿。之前的药理学研究表明该方剂对实验性肝损伤具有显著的保肝作用。金丝桃苷（Hyp）是一种主要富集于山楂和荷叶等植物中的黄酮苷，据报道具有强大的抗炎、抗氧化和抗纤维化活性，并在酒精性和化学性肝损伤模型中显示出保肝作用。然而，金丝桃苷在NAFLD中的潜在作用尚未被深入研究。
基于这些发现，本研究旨在系统评估金丝桃苷对高脂高糖饮食诱导的NAFLD大鼠肝脏病理、脂代谢和炎症的保护作用。通过利用16S rRNA测序和非靶向代谢组学，我们进一步探讨金丝桃苷的治疗作用是否与肠道菌群重塑和血清代谢谱调控相关。本研究旨在阐明金丝桃苷改善NAFLD的机制基础，并为其作为NAFLD预防和治疗的天然药物的潜力提供关键的实验和理论证据。
材料与方法
动物与分组
所有动物实验程序均经东莞市第六人民医院动物伦理委员会批准，并遵循ARRIVE指南（2020版）和中国《实验动物护理和使用指南》进行。研究使用32只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠（6-8周龄，180-220克），在SPF设施中适应性饲养1周后，随机分为五组：正常对照组（n=7）、NAFLD模型组（n=7）、NAFLD+金丝桃苷低剂量组（Hyp-L，0.6 mg/kg/天，n=6）、NAFLD+金丝桃苷高剂量组（Hyp-H，1.5 mg/kg/天，n=6）和NAFLD+罗格列酮阳性对照组（5 mg/kg/天，n=6）。样本量基于先前采用相同动物模型和干预设计的NAFLD研究确定。
NAFLD模型诱导与药物干预
NAFLD大鼠通过8周高脂高糖饮食建模，对照组饲喂标准饲料。第8周时，处死对照组和模型组各一只大鼠，取肝组织进行苏木精-伊红（H&E）染色，组织学分析确认出现明显肝脂肪变性，表明模型诱导成功。药物干预从第8周开始，持续4周，在此期间除正常对照组外均维持高脂高糖饮食。各治疗组通过灌胃给予相应药物或溶剂。
样本收集与处理
在实验第0、2、4、8（建模结束）、10（干预2周后）和12周（实验结束）测量体重。第12周禁食12小时后采集血样，分离血清，用于测定丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）以及代谢组学分析。采血后立即处死大鼠，取出肝脏称重计算肝指数（肝湿重/体重×100%），并记录大体形态特征。肝组织分为三部分：一部分用4%多聚甲醛固定用于组织学染色（H&E和天狼星红）；其余部分于-80°C保存用于RT-qPCR等后续分析。在处死前12小时收集新鲜粪便样本，迅速冷冻后于-80°C保存用于16S rRNA基因测序分析肠道菌群。
石蜡包埋肝切片制备
固定后的肝组织经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡浸透后包埋，切片机切取4μm厚切片，贴片后烘烤备用。
H&E染色
石蜡切片经脱蜡、水化后，用苏木精染色5分钟，盐酸酒精分化，流水返蓝，伊红复染2-8秒，随后脱水、透明、中性树胶封片。在光镜下（400倍）观察组织病理学改变，随机选取每个切片五个不重叠视野进行评估，按照2020年NAFLD诊断和管理指南对脂肪变性和炎症浸润进行分级（0-3分），评分越高反映肝损伤越严重。
天狼星红染色
脱蜡水化后的切片用苏木精染色5-10分钟，再用天狼星红溶液避光染色15-30分钟，蒸馏水洗涤后脱水、透明、封片。胶原纤维在明场显微镜下呈红色。使用倒置显微镜采集图像，并通过Image-Pro Plus 6.0分析每个切片五个随机不重叠视野的胶原面积分数，以客观评估肝纤维化。
血清生化检测
使用全自动生化分析仪和商业试剂盒测定血清ALT、AST、TG和TC水平。
定量实时PCR（qRT-PCR）
从100 mg肝组织中提取总RNA，测定浓度和纯度后，反转录合成cDNA。使用SYBR Green法和基因特异性引物进行定量PCR扩增，以Gapdh为内参，采用2-ΔΔCT法计算Tlr4、Tnf-α和α-SMA mRNA的相对表达水平。
16S rRNA基因测序与肠道菌群分析
从200 mg粪便样本中提取基因组DNA，扩增16S rRNA V4-V5区域。PCR产物经纯化、定量、等量混合后，在Illumina MiSeq平台上进行测序。对原始测序数据进行质控过滤后，使用UPARSE以97%相似度聚类为操作分类单元（OTUs）。使用Mothur计算Chao1和Shannon指数评估α多样性，在R语言中进行主坐标分析（PCoA）评估β多样性。使用RDP Classifier对Silva数据库进行物种分类注释。通过柱状图、热图、维恩图等可视化各分类水平（门、属、种）的相对丰度以及组间共享和特有OTUs。
非靶向代谢组学分析
取50μL血清样本，冰甲醇-乙腈（1:1）沉淀蛋白，离心取上清，真空冷冻干燥后复溶，过滤后进行UPLC-MS/MS分析。色谱分离使用ACQUITY UPLC BEH C18柱，质谱采用电喷雾电离（ESI）正负离子模式同时检测。使用Progenesis QI处理代谢组数据，进行峰识别、对齐、归一化等。通过多元分析（SIMCA 14.1；VIP > 1.0, p < 0.05）筛选差异代谢物，并利用HMDB/Metlin进行注释。随后在MetaboAnalyst 5.0中进行KEGG通路富集分析。使用R语言绘制差异代谢物热图。
统计分析
数据以均值±标准差表示。使用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.0进行统计分析。多组间比较（如体重、肝指数、血清生化、基因表达水平）采用单因素方差分析（ANOVA），事后两两比较采用LSD-t检验。p < 0.05认为有统计学意义。对于OTU水平分析（16S rRNA测序），多重比较采用错误发现率（FDR）校正（Benjamini–Hochberg法），阈值q < 0.05。对于代谢物水平分析（非靶向代谢组学），差异代谢物的筛选结合了PLS-DA的VIP > 1.0和FDR校正后的p < 0.05。采用7折交叉验证确定PLS-DA最佳潜变量数，并进行200次置换检验验证模型可靠性。肠道微生物属与血清代谢物之间的相关性分析采用Spearman等级相关系数，并进行FDR校正（q < 0.05）。
结果
金丝桃苷减轻NAFLD大鼠体重增加、肝指数及肝脏组织病理学改变
动态体重监测显示，正常对照组大鼠体重稳步增长。从第4周起，NAFLD模型组体重显著增加，证实肥胖表型诱导成功。与模型组相比，金丝桃苷低、高剂量组从第8周后体重增加显著减弱，高剂量组效果更明显，罗格列酮阳性对照组也能有效控制体重，表明金丝桃苷以剂量依赖方式发挥抗肥胖作用。
模型组肝指数显著升高，证实存在严重的脂质积聚。金丝桃苷治疗显著降低了低、高剂量组的肝指数，高剂量组效果更佳。组织病理学检查证实了这些观察结果。H&E染色显示对照组肝细胞排列规则，胞质均匀，无脂滴；模型组则出现大量大小不一的细胞内脂滴、肝细胞肿胀和轻度炎症浸润。金丝桃苷干预后，低剂量组脂滴数量减少，细胞结构改善；高剂量组肝脂肪变性明显改善，组织形态接近对照组。天狼星红染色评估肝纤维化，模型组可见明显的纤维间隔形成，而金丝桃苷治疗，尤其是高剂量组，几乎完全抑制了纤维化进展，胶原面积显著减少，效果与罗格列酮相当。这些结果表明金丝桃苷能有效缓解肥胖相关表型，减轻肝脏脂质负荷，改善肝细胞结构，并有效抑制纤维化进展，显示出多方面的保肝作用。
金丝桃苷改善肝功能，缓解脂代谢紊乱，并调节关键炎症和纤维化标志物
为评估金丝桃苷对肝功能的影响，检测了血清ALT和AST水平。模型组两种酶均升高，反映进行性肝细胞损伤。金丝桃苷治疗，特别是高剂量，显著降低了ALT和AST水平，表明对肝细胞的保护作用。
在脂代谢方面，模型组TC和TG显著升高。金丝桃苷高剂量组表现出显著的降脂作用，TC和TG水平明显降低；低剂量组有改善趋势。罗格列酮组也能有效降低血清脂质水平。
qRT-PCR分析显示，与对照组相比，模型组Toll样受体4（Tlr4）表达显著上调，提示肠道来源内毒素激活了天然免疫信号。金丝桃苷治疗以剂量依赖方式显著抑制了Tlr4表达。同时，促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（Tnf-α）在模型组中显著上调，金丝桃苷低、高剂量组均有效下调了Tnf-α表达，显示出强大的抗炎活性。
关于纤维化，肝星状细胞活化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在模型组中显著升高。金丝桃苷治疗，特别是高剂量，显著抑制了α-SMA表达，低剂量组也表现出中等程度的抑制，效果与罗格列酮相当。金丝桃苷通过多靶点抑制Tlr4/Tnf-α轴和α-SMA介导的纤维化，改善了肝功能和脂质代谢。
金丝桃苷重塑NAFLD大鼠肠道微生物结构与多样性
α多样性分析显示，对照组和罗格列酮组物种丰富度（Chao1指数）最高，群落多样性（Shannon指数）相对较高。模型组Shannon指数最高但Chao1指数略低，提示均匀度增加但整体复杂性降低。值得注意的是，金丝桃苷高剂量组物种丰富度和多样性最低，提示高剂量干预可能选择性富集特定类群，导致微生物群落简化。低剂量组多样性介于中间，更接近对照组。
PCoA显示组间存在显著结构差异。对照组和模型组明显分离，表明疾病状态深刻改变了微生物组成。金丝桃苷高剂量组与其他组差异最大，表明对肠道菌群有强烈的重塑作用。低剂量组与模型组部分重叠，影响较温和。罗格列酮组与模型组聚类更近。
维恩图分析进一步说明了微生物组成的独特和共享特征。对照组拥有最多的独特OTUs（n=1161），模型组有609个独特OTUs，而金丝桃苷高剂量组仅有324个独特OTUs，但与对照组共享相对较多的OTUs，提示其向更健康的微生物状态转变。五个组共享193个核心OTUs，可能代表宿主稳态所必需的基础微生物类群。
在门水平上，厚壁菌门在所有组中占主导，其次是拟杆菌门。然而，模型组纤维杆菌门和梭杆菌门显著增加，疣微菌门等减少，表明潜在致病菌扩张和菌群失调。金丝桃苷低剂量组拟杆菌门丰度恢复，并富集了脱硫杆菌门、螺旋体门等有益代谢类群。高剂量组变形菌门增加，厚壁菌门稳定性降低。罗格列酮组显示出正常化趋势，厚壁菌门减少，拟杆菌门增加。
在属水平上，Ligilactobacillus是所有组中的优势菌属。对照组富含多种乳酸杆菌（如Lactobacillus_sp.-YJ, uncultured_Lactobacillus_sp.），维持了健康的微环境。相比之下，模型组乳酸杆菌减少，潜在致病菌如Romboutsia和Clostridium_sensu_stricto_1丰度增加。金丝桃苷低剂量组乳酸杆菌恢复，并富集了丁酸盐产生菌属如Tyzzerella_sp.和Roseburia_sp.。高剂量组乳酸杆菌减少，但Streptococcus_sp._GDLAMI-SD2和Collinsella_intestinalis增加。罗格列酮组部分恢复了某些乳酸杆菌（如L. crispatus）。这些结果表明金丝桃苷显著调节NAFLD大鼠的肠道微生物结构，低剂量干预促进以乳酸杆菌为主导的健康微生物群，而高剂量治疗可能通过选择性富集功能类群发挥更强的治疗作用。
金丝桃苷调节关键功能菌属并识别潜在生物标志物
对前30个差异丰度属进一步分析。丁酸盐产生菌属如Lachnospiraceae_NK4A136_group、UCG-005和Blautia在各组中相对丰富。值得注意的是，这些菌属在金丝桃苷低剂量组呈下降趋势，可能反映了由于代谢改善宿主对丁酸盐的依赖减少。相比之下，模型组链球菌属和大肠杆菌-志贺氏菌属略有增加，提示潜在病原菌扩张。在属水平上，模型组Allobaculum显著升高，但药物干预后显著降低。NK4A214_group、Monoglobus和Clostridium_sensu_stricto_1也观察到类似趋势。相关性分析显示，具有相似生态功能的属（如纤维降解菌或SCFA产生菌）通常表现出强正相关，反映了功能互补性。而偏好不同微环境的属（如Dorea与Christensenellaceae）或“有益菌与致病菌”对（如Faecalibacterium与Desulfovibrio）通常表现出强负相关，表明生态拮抗。进一步分析显示，目标表型（指某些有益菌属或功能模块）的相对丰度在模型组显著降低，提示疾病条件下肠道微生态功能受损。干预后，尤其是高剂量组，该表型微生物的丰度显著增加。罗格列酮组也表现出有利趋势。这些发现表明金丝桃苷可能通过抑制疾病相关类群和重新平衡有益微生物来恢复整体肠道微生物功能。
金丝桃苷显著改变血清代谢组谱并调节关键代谢通路
对血清样本进行非靶向代谢组学分析。PCA显示对照组样本形成一个独特且紧密的簇，与其他组明显分离。模型组偏离正常代谢轨迹，而治疗组——特别是金丝桃苷高剂量组——趋向于重新聚类，表明金丝桃苷逆转了代谢紊乱。共鉴定出1839种代谢物。与对照组相比，模型组表现出显著的代谢重编程，表现为多个通路的广泛上调和下调。热图分析显示模型组中3-羟基丁酸（3-HB）、DG(18:2/15:0)和二甲甘氨酸显著富集，金丝桃苷治疗后这些代谢物显著减少。雷达图分析突出显示1-O-Hexadecyl-2-O-(N-methylcarbamoyl)-sn-glyceryl和PC(37:2)为关键判别代谢物。相关性分析显示3-HB和DG类代谢物与大多数其他代谢物呈负相关，提示它们在代谢网络中的核心作用。
KEGG通路富集分析表明，“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”以及“α-亚麻酸代谢”通路显著富集。前者与一碳代谢、抗氧化防御和脂质合成密切相关；后者包含最多数量的富集代谢物，突出了不饱和脂肪酸重编程在NAFLD中的重要性。调控网络分析揭示了枢纽代谢物，如乙酰辅酶A、柠檬酸和苹果酸，它们连接糖酵解、TCA循环和脂肪酸合成，形成中心代谢节点。金丝桃苷诱导的代谢变化与这些关键节点的调节相关，这可能是其系统调控作用的基础。
肠道菌群与代谢物之间的相互作用
为了探索“微生物-代谢物-宿主”相互作用，构建了属水平肠道菌群与关键差异代谢物之间的相关性热图。有益菌属如Faecalibacterium和Lachnospiraceae_UCG-010通常与促炎代谢物（如溶血磷脂酰胆碱LPC, LysoPC）和酮体（如3-HB）呈负相关，提示其保护作用与有害代谢物水平降低相关。相反，潜在致病菌如Rickettsiales_unclassified和Dorea与脂质代谢物（如DG和TG）呈正相关，表明它们与脂质积聚和炎症增加相关，从而加剧NAFLD进展。值得注意的是，LPC和LysoPC成为多个细菌属共同的相关目标，提示它们是连接肠道菌群失调与宿主脂代谢紊乱的关键介质。这些结果表明，金丝桃苷可能通过重塑肠道菌群和调节关键代谢通路——特别是氨基酸和脂肪酸代谢——来改善系统性代谢紊乱，最终实现对NAFLD的多维度干预。
讨论
NAFLD的发病机制涉及肝脂质积聚、氧化应激、慢性炎症和纤维化通路激活之间复杂的相互作用，越来越多的证据强调肠道菌群失调在促进疾病进展中的关键作用。目前尚无获批用于NAFLD治疗的药物，凸显了对安全有效干预措施的迫切需求。本研究系统证实了天然黄酮苷金丝桃苷在大鼠HFD诱导的NAFLD中提供多维度保护。其机制涉及重塑肠道菌群和重编程血清代谢物，从而减轻肝脂肪变性、炎症和纤维化。我们的发现为金丝桃苷作为有前景的靶向微生物组治疗NAFLD的候选药物提供了令人信服的临床前证据。
金丝桃苷改善了NAFLD表型，降低了体重、肝指数、脂肪变性和纤维化。这些表型益处伴随着血清ALT和AST水平的显著降低，表明对肝细胞损伤的有效保护。此外，金丝桃苷有效降低了血清TC和TG水平，证明了其纠正系统性脂代谢紊乱的强大能力。这些发现与先前强调金丝桃苷抗氧化、抗炎和糖脂调节作用的研究一致。然而，本研究通过证明金丝桃苷在整个NAFLD谱系（从脂肪变性到早期纤维化）中的综合疗效，扩展了其药理学特征，从而将其定位为潜在的疾病修饰剂。
在机制上，我们发现金丝桃苷通过调节关键信号通路抑制肝脏炎症和纤维化。值得注意的是，NAFLD大鼠表现出Tlr4和Tnf-α的显著上调，提示TLR4/NF-κB通路激活，可能由肠道来源内毒素如LPS触发。金丝桃苷干预显著抑制了这一促炎级联反应，暗示其可能中断了“肠道来源炎症信号”向肝脏的传递。这种效应可能通过增强肠道屏障完整性或减少促炎细菌类群的定植介导。此外，金丝桃苷显著降低了α-SMA表达，特别是在高剂量下。这一发现表明金丝桃苷不仅能阻止甚至可能逆转早期纤维化过程，提供了超越脂肪变性进入更晚期NASH阶段的治疗潜力。
我们的16S rRNA测序结果显示金丝桃苷显著改变了NAFLD大鼠的肠道菌群组成。模型组表现出菌群失调，特征为Shannon多样性升高但Chao1丰富度降低，同时潜在致病菌如纤维杆菌门和梭杆菌门扩张。相比之下，金丝桃苷——特别是低剂量——恢复了有益乳酸杆菌的主导地位，并富集了丁酸盐产生菌属如Roseburia和Tyzzerella。这些菌属在维持肠道屏障完整性、产生SCFAs和调节免疫稳态方面的作用已得到充分证实。维恩分析进一步显示金丝桃苷高剂量组与对照组共享相对较多的核心OTUs，提示微生物群落结构向更健康状态趋同。这种微生物重塑很可能与宿主代谢和免疫平衡的恢复相关。
值得注意的是，金丝桃苷高剂量组表现出降低的α多样性（较低的Chao1和Shannon指数），但却具有最独特的PCoA聚类和强大的保肝活性，这引发了对这种微生物简化生态后果的关键探讨。虽然多样性降低通常与菌群失调交织在一起，但观察到的在高剂量下的下降很可能反映了对功能关键类群（如代谢有益细菌）的靶向富集，而非有害的失调——这一点通过同时肝病理表型的减轻和致病菌增殖（如Romboutsia, Clostridium_sensu_stricto_1）的缓解得到证实。关于这种“简化”微生物群落的恢复力，尚未完全证实，但其与对照组共享核心OTUs暗示了其在维持宿主代谢稳态方面的内在稳定性，尽管长期暴露可能使其易受生态脆弱性影响。关于治疗效果与微生物多样性之间的权衡，低剂量金丝桃苷在多样性和组成上更接近对照组微生物群，体现了一种更有利的生态配置，协调了治疗效力与微生物生态整体性。相反，尽管金丝桃苷高剂量有效，但其对肠道菌群施加了更强的选择压力，导致微生物简化，长期使用需谨慎。总之，这些发现说明低剂量金丝桃苷在菌群重塑效力与生态稳定性之间取得了最佳平衡，而高剂量干预则以牺牲微生物多样性为代价优先考虑短期肝脏改善——强调了剂量优化对于临床转化的重要性。
更重要的是，非靶向代谢组学揭示NAFLD诱导了血清代谢组的深刻转变，特征为3-HB、DGs和二甲甘氨酸的异常积聚。3-HB是一种主要酮体，通常在脂肪酸β-氧化增强和能量失衡条件下升高。DGs是与胰岛素抵抗和肝脂质沉积密切相关的生物活性脂质。金丝桃苷干预有效逆转了这些失调的代谢物，表明其逆转系统性代谢功能障碍的能力。KEGG通路富集揭示了“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”和“α-亚麻酸代谢”的显著变化。前者与一碳代谢、谷胱甘肽合成和氧化还原平衡——氧化应激防御的关键过程——密切相关。后者涉及具有抗炎和胰岛素增敏特性的ω-3多不饱和脂肪酸的合成。因此，金丝桃苷可能通过靶向这些关键代谢节点发挥系统性代谢重编程作用。
关键的是，相关性网络分析建立了肠道菌群与血清代谢物之间的功能联系，揭示了一个潜在的“微生物-代谢物-肝脏”级联。我们发现有益菌属如Faecalibacterium和Lachnospiraceae_UCG-010与促炎脂质（如LPC, LysoPC）和酮体呈负相关，而潜在致病菌（如Dorea, Rickettsiales_unclassified）与DGs和TGs呈正相关。值得注意的是，LPC和LysoPC是已知的TLR4/NF-κB通路激活剂和肝脏炎症诱导剂，它们被确定为该网络中的关键枢纽。因此，我们提出金丝桃苷诱导的有益微生物富集与LPC等有害代谢物水平降低相关，可能共同有助于减轻肝脏炎症——尽管因果关系需要进一步验证，从而形成一条“肠道微生物 → 血清代谢物 → 肝脏炎症”的调控轴。
本研究对金丝桃苷如何改善NAFLD提供了新的机制见解，证明了一个涉及肠道菌群重塑（特征为富集有益类群如乳酸杆菌、Roseburia和抑制致病菌如Romboutsia、Clostridium_sensu_stricto 1）、随后的血清代谢重编程（使失调代谢物如3-羟基丁酸、甘油二酯正常化并调节关键通路如甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、α-亚麻酸代谢）、以及 consequent 肝脏病理改善的多层次通路。其作用超越了单靶点抑制；相反，它协调地调节脂代谢、炎症和纤维化。尽管本研究未通过功能验证（如粪便微生物移植或代谢物补充）建立因果关系，但整合的16S rRNA测序和非靶向代谢组学分析揭示了肠道微生物改变、血清代谢转变和肝脏表型改善之间的显著相关性——
