《Frontiers in Genetics》：Multiple susceptibility enhancer variants increasing ADD3 expression predisposes to biliary atresia risk
背景
非综合征型胆道闭锁（BA）是一种多因素疾病，其遗传基础尚不清楚。先前研究在亚洲人群中发现ADD3基因座存在154个与BA相关的单核苷酸多态性（SNP），这些易感性SNP处于高度连锁不平衡状态，但因果变异仍未确定。
方法
利用现有数据库预测154个BA相关SNP的调控潜力。通过双荧光素酶报告实验评估含风险变异的顺式调控元件（CRE）的增强子活性。采用斑马鱼模型研究ADD3失调在肝胆发育中的作用，通过原位杂交绘制斑马鱼胚胎中ADD3同源基因的时空表达模式，并通过mRNA过表达和吗啡啉反义寡核苷酸（MO）敲降技术探讨扰动ADD3同源基因表达对斑马鱼肝胆发育的影响。
结果
在154个相关SNP中，28个聚集在10个预测具有增强子功能的假定CRE内。体外等位基因特异性荧光素酶实验显示，其中8个CRE具有增强子活性，3个位点的风险单倍型驱动活性显著高于非风险单倍型（P < 0.05）。斑马鱼add3a基因（人类ADD3的同源物）在发育中的肝脏表达。斑马鱼中add3a的过表达和敲降均破坏了肝胆功能和发育，导致胆囊发育不全/缺失和肝内胆管密度降低，这些表型密切再现了人类BA病理。结合先前数据显示风险等位基因与ADD3表达升高相关以及ADD3在BA肝脏中过表达，这些结果表明遗传变异驱动ADD3上调，从而 predispose to BA development。
结论
增强子内的多个风险变异上调了ADD3表达，从而促进了BA的发病机制。
1 引言
胆道闭锁（BA）是一种发生于婴儿的罕见胆管病。BA发病率在美国约为1/10,000，在亚洲部分地区可达3.7/10,000。BA存在两种形式：综合征型BA（约10%）和非综合征型BA（约90%）。综合征型BA伴有多种先天性异常，通常遵循孟德尔遗传规律。非综合征型BA则表现为孤立的胆管闭锁，无其他先天性异常，被认为是由遗传和环境因素共同作用的多因素疾病。
BA是一种进行性纤维炎症性疾病，累及肝外和肝内胆管。其诊断关键在于肝外胆管异常，但预后主要取决于即使在成功进行肝门肠吻合术后仍会发展的继发性进行性肝内胆管病。最近的遗传学发现暗示原发性纤毛在BA发病机制中起核心作用，并且在BA肝组织中发现整个肝内和肝外胆管的胆管细胞原发性纤毛存在结构缺陷。人胆管细胞系H69已被广泛用作研究BA致病机制的人体外模型。斑马鱼在肝胆形态发生和器官发生方面与哺乳动物具有显著的进化保守性，其肝外胆道解剖结构（包括胆囊）与哺乳动物系统高度保守，已被广泛用作BA研究的动物模型。
全基因组关联研究（GWAS）及后续重复研究显示，ADD3基因区域的rs17095355是中国人群中与BA易感性最显著相关的常见变异。该关联在白种人中也得到验证。先前的GWAS研究及插补分析在336名非综合征型BA婴儿和8900名对照中鉴定出rs17095355及该基因组区域内的其他153个SNP与BA存在全基因组显著关联。所有这154个SNP均与rs17095355呈高度连锁不平衡（r2> 0.9）。进一步通过eQTL分析发现rs17095355的风险等位基因与ADD3表达增加相关，并且ADD3异常沉积于胆管细胞和肝细胞中。斑马鱼模型中吗啡啉介导的add3a敲降导致肝胆管缺陷。然而，ADD3过表达在肝胆系统的影响尚待阐明。
目前公认大多数人类复杂疾病是由遍布基因组的数百至数千个变异的累积遗传效应所致。在每个易感位点，多个变异显示出与表型的统计学显著关联，但阐明功能独立贡献者的数量是一项挑战。这是因为邻近的遗传变异常常由于连锁不平衡（LD）而相关，这反映了共享的遗传模式而非共享的生物学效应。因此，仅靠统计方法无法可靠地区分因果变异与仅通过LD相关的非功能性变异。因此，通过扰动候选变异并评估其表型影响进行实验验证对于解析真正的因果关系至关重要。
ADD3变异被确定为与BA易感性最显著相关的位点。然而，几个主要问题仍未解答。首先，由于多个处于高度LD的SNP与BA风险相关，哪些SNP影响ADD3表达？其次，这些疾病相关等位基因是通过上调还是下调ADD3表达来增加BA易感性？第三，ADD3的上调是否会损害肝胆系统的结构和功能？在本研究中，我们检索可用数据库以预测154个相关SNP的潜在功能后果。然后，我们使用双荧光素酶报告实验评估了候选SNP的等位基因特异性表达。最后，使用斑马鱼模型评估敲降和过表达ADD3同源基因对肝胆管和胆囊发育的影响。
2 材料与方法
2.1 顺式调控元件变异的筛选
我们针对ENCODE和HaploReg数据库的调控注释查询了154个BA相关SNP。与组蛋白标记、DNase I超敏位点、蛋白质结合区域或转录因子 motif 重叠的SNP被预测位于顺式调控元件（CRE）内。我们系统筛选了SEdb 3.0数据库，以识别与实验验证的具有增强子活性的CRE共定位的超级增强子。
2.2 细胞培养
人H69胆管细胞在37°C、5% CO2条件下，于添加了10%胎牛血清和100 IU/mL青霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。
2.3 双荧光素酶报告实验
将包含28个候选SNP的侧翼DNA片段克隆到pGL4.23荧光素酶载体中。将24孔板中的H69细胞与pGL4.23构建体或空pGL4.23载体以及海肾荧光素酶对照载体共转染。转染后24小时，使用双荧光素酶报告 assay 系统在微孔板读数器上测量荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活性相对于海肾荧光素酶活性进行标准化以进行数据分析。
2.4 斑马鱼品系
所有斑马鱼实验均使用野生型AB品系，饲养于新华医院。实验程序根据机构指南进行，并得到新华医院动物护理和使用委员会批准。
2.5 实时聚合酶链反应（RT-PCR）
使用TRIzol试剂从5小时受精后（hpf）的胚胎中提取总RNA。使用SYBR Green Master Mix在实时PCR仪器上进行RT-PCR。18S核糖体RNA（18S rRNA）基因作为内参对照。所有实验重复三次。使用ΔΔCT方法计算相对基因表达水平，表示为RQ值（RQ = 2?ΔΔCT）。
2.6 整体原位杂交（WISH）
从1 μg总RNA合成第一链cDNA。设计PCR引物产生靶向斑马鱼add3a的456-bp反义核糖核酸探针。将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中。然后使用线性化质粒模板合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。
在24 hpf时，将幼虫维持在0.003% 1-苯基-2-硫脲（PTU）中以抑制黑色素形成。将斑马鱼胚胎在4%多聚甲醛中于4°C孵育过夜进行固定，随后脱水并在100%甲醇中于-20°C储存≥2小时。在立体显微镜下用细镊子手动去除幼虫的卵壳。大于1 dpf的胚胎用蛋白酶K（10 μg/mL）处理15-30分钟（室温）以促进探针渗透。
预杂交后（2-4小时，60°C），将胚胎与600 ng反义探针在60°C杂交过夜。封闭后（3小时，室温），样品与抗DIG-AP抗体（1:5000）在4°C孵育过夜。使用BM Purple AP底物进行信号检测，随后在立体显微镜下成像。
2.7 吗啡啉反义寡核苷酸设计与注射
设计并合成靶向add3a的吗啡啉反义寡核苷酸（MOs）。使用标准MO作为阴性对照。设计了翻译阻断（TMO）和剪接阻断（SMO），分别靶向5‘翻译起始位点和剪接受体位点。通过将SMO和TMO注射到1至4细胞期胚胎的卵黄中介导add3a敲降。将MOs稀释至0.25 mM，每胚胎注射约2 nL。为验证add3a剪接阻断吗啡啉（SMO）的效率，在显微注射后收集3 dpf的斑马鱼胚胎。提取总RNA，逆转录成cDNA，并通过RT-PCR和凝胶电泳分析以检测指示成功敲降的异常剪接产物。为验证TMO效力，我们从斑马鱼cDNA中PCR扩增包含TMO靶序列的118-bp片段，并将其亚克隆到pEGFP-N1质粒中。TMO与该报告构建体共注射后荧光减弱证实了翻译抑制的成功。
2.8 mRNA体外合成与注射
以5 dpf斑马鱼卵的cDNA为模板，通过RT-PCR用高保真酶扩增add3a的全长编码序列。通过凝胶提取纯化全长add3a片段。在引物5’端添加与线性化载体末端和限制性酶切位点对应的同源序列。用EcoR I酶切线性化pCS2+空载体。然后将纯化的PCR产物克隆到线性化的pCS2+载体中。将含有add3a的质粒用KpnI线性化，并用作体外转录的模板以产生全长mRNA。使用带有SP6聚合酶的mMESSAGE mMACHINE Kit转录加帽mRNA。将100 pg add3a mRNA注射到一至四细胞期胚胎中。
2.9 PED6处理
PED6是磷脂酶A2的荧光底物。它在肝脏代谢并排泄到胆汁中，在胆囊积聚。为直接观察胆囊，将5 dpf斑马鱼胚胎与0.1 mg/mL PED-6孵育超过2小时。使用立体荧光显微镜获取PED-6 assay 图像。根据胆囊大小和PED-6荧光强度将每组胚胎分类为“正常”、“微弱”或“缺失”。
2.10 通过整体免疫荧光分析胆道结构
将5 dpf的斑马鱼幼虫在甲醇:DMSO（4:1）中于室温固定2小时，随后在100%冰甲醇中后固定以长期储存。通过PBSX中的梯度甲醇系列再水化后，小心去除幼虫表皮以增强抗体渗透。样品在10%牛血清白蛋白（BSA）和0.5% Triton X-100中于室温封闭1小时。
使用小鼠抗角蛋白18单克隆抗体（1:100稀释）在4°C轻摇条件下进行一抗孵育过夜。用PBSX充分洗涤后，样品与Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG二抗（1:500稀释）在4°C孵育过夜。
将免疫染色的幼虫封固于甘油中，并使用共聚焦显微镜成像。使用Adobe Photoshop CS6处理图像，并使用ImageJ软件进行定量形态学分析（肝内胆管长度和胆囊面积）。
2.11 统计分析
使用GraphPad Prism软件进行统计分析。数据表示为平均值±标准误。使用Shapiro-Wilk或Kolmogorov-Smirnov检验评估正态性，当满足参数假设时，接着进行Levene方差齐性检验。正态分布数据使用双尾Student t检验（两组比较）或单因素方差分析（多组比较）进行分析。分类数据使用χ2检验进行分析。所有分析中，双侧P值< 0.05被认为具有统计学显著性。
3 结果
3.1 顺式调控元件变异的筛选
在一项针对中国人群BA易感性的GWAS中，我们鉴定出154个达到全基因组显著性（P < 5 × 10?8）的SNP，包括先导变异rs17095355。所有这些SNP位于ADD3的5‘上游基因间区或内含子中，并与rs17095355呈高度LD（r2> 0.9）。eQTL分析显示rs17095355的风险等位基因与ADD3表达增加相关。为识别154个BA相关SNP中的因果变异，我们通过查询ENCODE和HaploReg的数据筛选位于顺式调控元件（CRE）内的SNP。该分析揭示了分布在10个不同CRE中的28个SNP，空间上聚集的SNP共定位于相同的CRE内。在28个相关SNP中，20个位于包含增强子特征组蛋白标记的区域，19个位于DNaseI超敏位点，7个与转录因子结合位点重叠，24个被预测会改变转录因子motif。
3.2 增强子活性的功能测试
我们对包含28个易感性SNP的10个CRE进行了增强子活性的体外功能测试。我们将以变异为中心的DNA片段克隆到PGL4.23荧光素酶载体中，并将其转染到人H69胆管细胞中。总共测试了10个元件。我们的结果显示，8个元件（E1, E2, E3, E4, E7, E8, E9, E10）表现出显著的增强子活性（与仅含启动子的对照载体相比，报告基因活性增加> 2倍，P < 0.0001），4个元件（E2, E4, E9, E10）显示出等位基因特异性报告基因活性差异。在后者中，75%的风险单倍型（E2, E4, E10）比其非风险对应物表现出更高的增强子活性。尽管包含先导SNP rs17095355的E1区域在我们的实验中显示出强增强子活性，但风险和非风险单倍型之间相似的活性水平意味着该SNP可能不是导致观察到的遗传关联的功能变异。
超级增强子（SEs）是由多个转录增强子组成的簇，可协同调节基因表达。在该区域，鉴定出8个具有增强子活性的元件，提示该位点可能作为SE发挥作用。为进一步探索，我们查询了SEdb 3.0。结果表明该区域在多种组织和细胞类型（包括肝组织）中作为SE发挥作用。
在E2，风险单倍型 C缺失T 显示比对照（基础启动子）高6.1倍的荧光素酶活性，并且比非风险单倍型高3.1倍的活性（P = 1.9 × 10?5）。在E4，风险单倍型 TA 显示比对照高8.2倍的荧光素酶活性，并且比非风险单倍型高2.7倍的活性（P = 1.4 × 10?6）。在E10，风险单倍型 TTTT 显示比对照高8.7倍的荧光素酶活性，并且比非风险单倍型高2.4倍的活性（P = 2.3 × 10?5）。我们先前的研究发现风险等位基因与ADD3表达增加相关，并且ADD3在BA胆管细胞和肝细胞中过表达。结合目前的结果，这些发现表明BA相关的风险等位基因通过上调ADD3表达促进了BA的发病机制。
3.3 add3a在发育斑马鱼胚胎中的时空表达
为探索ADD3失调在肝胆发育中的作用，我们采用斑马鱼作为模型系统。我们首先使用RT-PCR和WISH实验研究斑马鱼中人类ADD3的同源物add3a是否在发育中的肝脏表达。qPCR结果显示add3a的表达在4 hpf时存在，逐渐增加直至48 hpf达到峰值，之后其表达略有下降并趋于稳定。WISH结果显示add3a在24-96 hpf时主要在头部表达，并在72 hpf和96 hpf时观察到在肝脏表达。这些观察到的表达模式强烈表明add3a可能参与肝胆系统的发育。
3.4 add3a的过表达和敲降均损害肝胆发育
在add3a表达分析之后，我们在斑马鱼中过表达add3a，以模拟在BA肝脏中观察到的ADD3上调对肝胆功能和结构的影响。先前研究报道敲降add3a会导致肝内缺陷和胆道功能受损；因此，我们也进行了敲降分析以进行比较。
我们通过将add3a mRNA注射到斑马鱼胚胎中来过表达add3a，以评估其对肝胆发育的影响。RT-PCR显示add3a表达显著上调。与对照组相比，注射add3a mRNA的幼虫胆囊中PED6积聚显著减少，提示肝胆功能受损。我们通过细胞角蛋白18免疫荧光染色检查肝脏和胆囊。与对照幼虫相比，add3a过表达幼虫出现明显的胆道异常。相对于对照MO幼虫，add3a过表达幼虫表现出肝内胆管密度降低，以及相互连接的胆管和末端小胆管数量减少。此外，与对照组相比，add3a过表达幼虫的胆囊更小，细胞数量显著减少，平均细胞面积也更小。
我们通过MO介导的敲降来降低add3a表达，使用了SMO和TMO。SMO靶向add3a的外显子1剪接受体位点，而TMO靶向第一个外显子中的翻译起始区域。我们确认了MO的效率：SMO注射降低了RT-PCR上的条带亮度，TMO注射消除了PEGFP-N1质粒的荧光。SMO与过表达构建体共注射产生的条带强度高于单独使用SMO。将全长add3a过表达mRNA与SMO或TMO共注射进行的拯救实验部分恢复了MO诱导的表型，支持了MO的特异性。SMO和TMO介导的敲降减少了胆囊中的PED6积聚，并损害了肝内胆管发育以及胆囊形态。
总体而言，我们的研究结果表明add3a对斑马鱼正常的肝胆发育至关重要。肝胆发育对add3a水平高度敏感，因为过表达和敲降都会导致破坏，表明精确的剂量控制是必需的。这些体内数据共同支持了BA相关风险等位基因通过上调ADD3表达促进BA发病机制的观点。
4 讨论
我们先前的研究鉴定出154个与BA风险相关的处于高度LD的非编码SNP。在本研究中，生物信息学预测显示28个SNP位于增强子区域并干扰转录因子结合位点。位于三个区域的8个SNP显示出增强子活性，并且风险单倍型比其非风险对应物表现出更高的增强子活性。这些结果表明多个疾病相关SNP可能协同增强ADD3表达水平。在斑马鱼模型中过表达ADD3同源物导致肝胆功能和结构受损，这模拟了人类BA的表型。
我们目前来自人类遗传学和增强子活性体外功能测试的数据确定了ADD3周围的8个不同的CRE，它们含有与BA相关的常见序列变异。但只有4个CRE在增强子活性上显示出等位基因特异性差异，其中三个的风险等位基因显示出上调活性。这些CRE可能在一个拓扑关联域（TAD）内控制ADD3表达。可以合理地推测它们作为超级增强子协同作用并聚集在一起，从而显著放大ADD3表达。这些发现与我们先前研究和其他课题组的研究结果一致，表明ADD3在BA胆管细胞和肝细胞中过表达。值得注意的是，E9处的风险单倍型 GC 显示比对照（基础启动子）高3.1倍的荧光素酶活性，但比非风险单倍型低1.6倍的活性（P = 0.004）。三个CRE（E2, E4, E10）的风险单倍型一致地表现出增加的荧光素酶活性，而E9的风险单倍型相对于其非风险对应物显示出降低的活性。这种差异效应可能由两种非互斥的机制解释：（1）组织特异性调控背景 - E9位点可能与我们的异源报告实验系统中缺乏的胆管细胞特异性抑制因子相互作用；（2）转录资源竞争 - GC风险单倍型可能与其他增强子元件竞争有限的转录机制组件，导致净活性减弱。综上所述，风险SNP协同上调ADD3表达，从而促进BA发病机制。
ADD3编码内收蛋白3。如示意图所示，内收蛋白是由α/β或α/γ异源二聚体组成的四聚体蛋白。在大多数组织中，包括肝脏和胆道系统，ADD1与ADD3形成异源二聚体。作为一种肌动蛋白结合蛋白，内收蛋白通过封盖肌动蛋白丝的快生长末端并促进其成束，在调节丝动力学中起关键作用。重要的是，内收蛋白是一种膜骨架蛋白，通过连接血影蛋白-肌动蛋白网络参与细胞膜的结构支持。通过稳定血影蛋白和肌动蛋白之间的连接，内收蛋白有助于维持细胞形状并防止细胞膜的机械不稳定性。我们在斑马鱼中的结果发现敲降和过表达ADD3同源物都会导致胆囊细胞异常和肝内胆管稀疏。这些发现暗示ADD3失调导致细胞形状改变并参与BA的发生。
血影蛋白-内收蛋白介导的连接处周围F-肌动蛋白带的膜附着通过将粘附连接（AJ）/紧密连接（TJ）蛋白限制在顶端细胞表面并限制其在质膜内的扩散，有助于稳定连接结构。内收蛋白的耗竭直接破坏上皮粘附连接（AJs）的形成，随后阻碍紧密连接（TJs）的重组。在BA肝脏中观察到胆管细胞和肝细胞的细胞连接和极性复合物组装存在缺陷。这些证据表明ADD3失调损害连接复合体，从而促进BA的发病机制。
肌动蛋白在纤毛发生和纤毛维持中也起着关键作用，既存在于细胞质中也存在于纤毛区室中。细胞质肌动蛋白-内收蛋白细胞骨架控制中心体向顶端质膜的迁移和锚定、囊泡向中心粒的运输以及信号受体进入纤毛膜，从而调节信号传导。F-肌动蛋白也定位于原发性纤毛中。它是轴丝细胞骨架的一个组成部分，位于α-微管蛋白单联体和微管与纤毛膜之间。它形成胞吐作用的位点，并调节纤毛介导的信号传导。肌动蛋白也存在于纤毛膜中，从而调节纤毛膜的通透性。影响纤毛结构和功能的基因突变会引起一组称为纤毛病的遗传性疾病。BA患者中存在多种肝脏表达的纤毛基因的罕见有害突变，暗示BA是一种纤毛病。由于内收蛋白在肌动蛋白聚合和细胞骨架动态稳定性中起重要作用，我们认为ADD3失调直接损害胆管细胞的纤毛稳态，随后影响BA发病机制。
总之，我们鉴定了顺式调控元件内多个与BA相关的SNP，这些SNP表现出增强子活性。风险等位基因与ADD3表达增加相关。ADD3的上调和下调都会破坏肝胆结构和功能。由这些相关SNP的协同效应驱动的ADD3上调促进了BA的发病机制。
