《Molecular Plant Pathology》：Effects of Lipopolysaccharide Core Modulation on Outer Membrane Protein Function and Virulence in Pectobacterium carotovorum
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本研究深入揭示了脂多糖（LPS）核心结构完整性对胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）毒力的关键调控作用。文章通过构建系列LPS核心合成基因突变体，发现LPS核心截断会破坏外膜完整性，并特异性损害I型分泌系统（T1SS）外膜组分PrtF的定位及鞭毛功能，从而显著削弱细菌在植物体内的定殖能力与致病性。研究首次报道了转录抗终止因子RfaH在该病原菌中虽调控O抗原合成但对毒力非必需，凸显了LPS核心结构在维持外膜蛋白功能中的核心地位，为开发针对细菌外膜相关毒力机制的新型防控策略提供了重要理论依据。
1 引言
胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）是引起多种经济作物细菌性软腐病的坏死性病原体。其成功定殖寄主依赖于外膜作为抵御植物产生的抗菌化合物、酸性pH和活性氧等恶劣条件的保护屏障。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜不对称脂质双层外叶的关键组分，对于维持外膜的结构和功能完整性至关重要。LPS基本结构由三个区域组成：锚定在外膜上的磷酸化糖脂（脂质A）、核心寡糖和表面暴露的聚糖聚合物（O抗原）。核心寡糖又分为与脂质A相连的内核心，其特征是3-脱氧-D-甘露辛酮糖酸（Kdo）和庚糖，以及与O抗原相连的外核心，主要由己糖组成。LPS在细菌毒力中扮演关键角色，其缺陷会破坏外膜稳定性，影响膜蛋白的定位和活性，从而削弱毒力。
2 结果
2.1 PCC27中LPS生物合成基因的鉴定
对韩国胡萝卜软腐果胶杆菌模式菌株PCC27进行全基因组测序，揭示了其LPS生物合成基因簇。与其它肠杆菌相比，PCC27基因组缺乏负责将额外己糖单元掺入LPS核心的保守葡萄糖基转移酶基因，表明其LPS核心结构可能更短，主要由Kdo和庚糖组成。
2.2 LPS截断导致毒力、蛋白水解活性和运动性降低
通过构建rfaD、rfaF、rfaC、rfaQ和rfaL突变体，研究了LPS截断对表型的影响。LPS银染图谱显示，约11 kDa处的一条 distinct 条带可能代表O抗原。所有LPS突变体在泡菜白菜中脉上均表现出毒力显著降低，其中LPS核心突变体（ΔrfaD、ΔrfaF、ΔrfaC）的病变和体内细菌数量减少最为严重。虽然纤维素酶和果胶酶活性未变，但核心突变体的蛋白水解活性显著降低，ΔrfaQ突变体也显示活性降低，但高于核心突变体，而ΔrfaL突变体活性与野生型（WT）相当。在运动性方面，ΔrfaD和ΔrfaC突变体运动性显著降低，ΔrfaF突变体运动性低于WT但高于ΔrfaD和ΔrfaC。这些结果表明完整的LPS核心对胡萝卜软腐果胶杆菌的蛋白水解活性和运动性至关重要。
2.3 LPS截断损害外膜完整性
利用1-N-苯基萘胺（NPN）摄取实验评估外膜完整性，发现ΔrfaD、ΔrfaF和ΔrfaC突变体的荧光强度比WT增加超过2倍，表明膜通透性显著增加。对SDS和万古霉素的敏感性测试进一步证实，LPS核心缺陷会破坏外膜完整性及其功能。ΔrfaF突变体对万古霉素的敏感性与WT无差异，提示其LPS中额外的庚糖亚基可能在一定程度上稳定外膜蛋白。
2.4 LPS核心对T1SS外膜因子的组装至关重要
鉴于蛋白水解活性依赖于I型分泌系统（T1SS），而T1SS包含TolC同源蛋白PrtF，研究推测LPS核心截断可能破坏了T1SS装置的功能。逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析表明，T1SS结构基因和分泌蛋白基因的表达在LPS核心突变体中并未完全消失。Western blot分析显示，尽管PrtD、PrtE和PrtF蛋白在总细胞裂解物和膜组分中的表达量相似，但蛋白水解活性仍较低，表明缺陷发生在膜上组装层面。进一步的外膜蛋白组装实验通过蛋白酶K消化和Western blot分析证实，仅在LPS核心完整的菌株中能检测到受保护的PrtF截短片段（PrtF*），表明LPS核心截断破坏了PrtF在外膜中的正确定位。
2.5 LPS核心对完整的鞭毛功能必不可少
为探究LPS核心突变体运动性降低的机制，分析了鞭毛基因表达。ΔrfaD、ΔrfaF和ΔrfaC突变体中鞭毛主调控因子flhD的表达下调约2倍，下游基因也轻微下调。然而，在LPS核心突变体背景中删除rcsDB基因（Rcs磷酸中继系统的组成部分）仅部分恢复了flhD表达，且ΔrfaD/ΔrcsDB和ΔrfaC/ΔrcsDB双突变体的运动性并未完全恢复。通过诱导表达鞭毛sigma因子fliA来上调鞭毛基因，仍无法将ΔrfaD/ΔfliA和ΔrfaC/ΔfliA菌株的运动性恢复至WT水平，表明运动性受损主要源于鞭毛组件功能受损，而非基因表达下调。
2.6 RfaH是O抗原生物合成所必需但对胡萝卜软腐果胶杆菌的完全毒力非必需
基因组分析在wecA2基因上游鉴定到一个潜在的RfaH结合位点（ops元件）。RT-qPCR显示，在ΔrfaH突变体中，wecA2及其下游O抗原生物合成基因簇的表达显著下调，且距离ops位点越远的基因下调越明显，表明存在转录极性。LPS银染证实ΔrfaH突变体缺乏完整的O抗原条带，表型与ΔwecA2突变体相似。然而，与ΔrfaL和ΔwecA2突变体不同，ΔrfaH突变体在泡菜白菜上的毒力与WT相当，其PCWDE活性、运动性等主要毒力因子也未发生显著改变。这表明RfaH虽通过激活O抗原生物合成促进LPS合成，但对胡萝卜软腐果胶杆菌的完全毒力是可有可无的。
3 讨论
本研究揭示了胡萝卜软腐果胶杆菌PCC27的LPS核心结构相对简化，缺乏典型的外核心己糖添加。LPS核心结构的完整性对于维持外膜屏障功能、确保TolC同源蛋白PrtF在T1SS中的正确定位以及鞭毛装置的功能至关重要。LPS核心截断会通过破坏外膜蛋白功能而非主要通过影响其基因表达来削弱毒力相关表型。值得注意的是，尽管RfaH调控O抗原生物合成基因簇的表达，但其缺失并不导致毒力丧失，这与其它许多肠杆菌中的发现不同，可能是由于ΔrfaH突变体中仍存在低水平的O抗原，足以支持毒力，或者O抗原在该病原菌的致病过程中作用相对有限。
4 实验方法
（此部分为方法学概述，根据要求略去详细步骤）研究涉及细菌菌株培养、基因组测序、突变体与回补株构建、LPS提取与银染、植物毒力测定、PCWDE活性测定、运动性分析、外膜完整性（NPN摄取）与药物敏感性测定、基因表达（RT-qPCR）与蛋白（Western blot）分析、以及外膜蛋白组装测定等一系列分子微生物学、生物化学和植物病理学实验方法。
