基于AIE活性的二茂铁共轭咪唑荧光团用于过氧化氢“开启/关闭”检测及生物成像应用

《Talanta Open》：AIE-active ferrocene conjugated imidazole fluorescent chromophores for “ turn on/off” detection of hydrogen peroxide in mixed aqueous media and bio-imaging applications

本文推荐了一种新型AIE（聚集诱导发光）活性的二茂铁共轭Y-形咪唑荧光团（1和2），用于解决生物体系中H2O2检测选择性差、灵敏度低的问题。研究表明，该探针在混合水介质中通过RIR（限制分子内旋转）实现荧光增强，对H2O2具有高选择性"关闭"响应，检测限达纳摩尔级（24.7-30.9 nM），并成功应用于HeLa细胞的H2O2荧光成像，为活性氧相关疾病研究提供了新工具。

　　

在生物医学研究领域，过氧化氢（H₂O₂）作为关键的活性氧物种（Reactive Oxygen Species, ROS），在细胞增殖、凋亡、信号转导和免疫应答等生理过程中扮演着重要角色。然而，细胞内H₂O₂水平的异常与阿尔茨海默病、心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等多种疾病密切相关。因此，开发能够高效、精准检测H₂O₂的工具，对于理解其在生命系统中的功能以及探究其与相关疾病的精确关系至关重要。

目前常用的H₂O₂检测方法包括滴定法、光度法、荧光法、化学发光法和电化学技术等，但这些方法往往存在样品处理繁琐、操作复杂、可能破坏细胞和组织结构等缺点。其中，荧光分析技术因其使用简便、高灵敏度、无害性和良好生物相容性等优势，在生物分析特别是细胞成像中备受青睐。然而，现有荧光探针仍面临诸多挑战，如选择性差、吸收和发射光谱重叠、发射波长短、斯托克斯位移小、响应时间长等，这些限制阻碍了它们在生物成像中的实际应用。

聚集诱导发射（Aggregation-Induced Emission, AIE）发光团的出现为这一领域带来了新的希望。与传统荧光团在聚集状态下发生荧光猝灭（Aggregation-Caused Quenching, ACQ）不同，AIE发光团在聚集或固态下表现出强烈的发光行为，其机理主要归因于限制分子内旋转（Restricted Intramolecular Rotation, RIR）。这一特性使AIE荧光探针在生物成像、环境监测和有害分子检测等传感应用中展现出巨大潜力。

在此背景下，印度韦洛尔理工学院高级科学学院化学系功能材料中心的Selvam Prabu和Nallasamy Palanisami研究团队在《Talanta Open》上发表了一项创新性研究，他们成功合成了一类新型的AIE活性二茂铁共轭Y-形甲氧基苯基取代咪唑衍生物，并将其应用于H₂O₂的检测和生物成像。这类探针不仅克服了传统荧光探针的局限性，还展现出了优异的检测性能和生物相容性。

研究人员为开展此项研究，主要采用了以下几个关键技术方法：通过Debus-Radziszewski缩合反应合成二茂铁共轭Y-形咪唑荧光团；利用核磁共振（NMR）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和高分辨质谱（HR-MS）进行结构表征；通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱研究光学性质；采用循环伏安法评估电化学行为；使用时间相关单光子计数技术测量荧光寿命；通过MTT法评估细胞毒性；利用共聚焦显微镜进行细胞成像研究；基于DFT/B3LYP理论计算分析分子轨道和电荷分布。

2.1. 合成和光谱性质

研究人员通过Debus-Radziszewski缩合反应，使二茂铁甲醛与1,2-双(4-甲氧基苯基)乙烷-1,2-二酮（1）和(1E,5E)-1,6-双(4-甲氧基苯基)己-1,5-二烯-3,4-二酮（2）在醋酸铵和醋酸存在下回流3小时，成功合成了两种二茂铁共轭Y-形咪唑荧光团。通过熔点测定、FT-IR、元素分析、HR-MS、¹H和¹³C NMR光谱分析对这两种荧光团进行了全面表征，确认了其化学结构和纯度。

2.2. 电化学研究

循环伏安法研究显示，荧光团1和2在433-606 mV范围内表现出单电子氧化还原电对，对应于二茂铁向二茂铁鎓离子（Fe²⁺?Fe³⁺）的转化。与未取代二茂铁相比，这些荧光团的半波电位值更高（E_1/2= 571 mV for 1，499 mV for 2），表明取代基性质对氧化还原电位有显著影响。电化学数据还提供了最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占分子轨道（LUMO）能级的信息。

2.3. 光学性质

吸收光谱研究表明，荧光团1和2在200-650 nm波长范围内显示出三个主要吸收带，分别对应于π-π跃迁（240-281 nm）、n-π跃迁（290-375 nm）和d-d跃迁（430-470 nm）。荧光发射光谱显示，当在294 nm（1）和281 nm（2）激发时，荧光团在394 nm（1）和455 nm（2）处出现发射峰。由于二茂铁部分通过光诱导电子转移（Photoinduced Electron Transfer, PET）机制产生显著的荧光猝灭，这两种荧光团都表现出较弱的荧光强度。

2.4. 聚集诱导发射

在乙腈（CH₃CN）溶液中，荧光团1和2仅表现出微弱的荧光发射，但在加入水形成聚集态后，荧光强度显著增强。当水分数（f_w）达到80%（1）和70%（2）时，荧光强度分别增强了6倍和2倍。这种AIE现象归因于聚集态下的空间位阻和π-π相互作用限制了分子内旋转，阻止了非辐射途径，增强了辐射跃迁。在聚集态下，荧光团1和2的量子产率分别比纯CH₃CN溶液提高了3倍和2倍。

2.5. AIE活性荧光对H₂O₂的响应

研究发现，这些AIE发光团可以通过聚集诱导发射机制检测H₂O₂。在PBS缓冲溶液中，随着H₂O₂浓度的增加，荧光团1和2的发射强度逐渐降低，表现出典型的荧光"关闭"响应。 Stern-Volmer分析表明，荧光团1和2对H₂O₂的检测限分别为24.7 nM和30.9 nM，表现出高灵敏度和特异性。

2.6. 时间分辨荧光寿命衰减

时间相关单光子计数技术测量显示，在CH₃CN/H₂O混合物中，荧光团1和2的荧光寿命分别为5.6 ns和7.1 ns。加入H₂O₂后，荧光寿命缩短至4.4 ns和5.9 ns，同时辐射衰减速率（K_r）降低，非辐射衰减速率（K_nr）增加，这解释了H₂O₂引起的荧光猝灭现象。

2.7. 在细胞成像中的应用

MTT实验表明，即使在高浓度（300 μM）下，荧光团1和2对人宫颈癌（HeLa）细胞也没有明显毒性（细胞存活率超过80%），表明它们具有良好的生物相容性。共聚焦显微镜成像显示，荧光团能有效穿透细胞膜，在HeLa细胞内分布均匀。加入H₂O₂后，明亮的绿色荧光被猝灭，证明这些荧光团能够检测细胞内的H₂O₂。

2.8. DFT研究

密度泛函理论计算表明，荧光团1和2的HOMO主要定域在二茂铁部分和甲氧基苯基上，部分分布在咪唑单元上；而LUMO则部分定域在咪唑单元和芳香环对位的甲氧基苯基上。时间依赖的密度泛函理论计算成功指认了荧光团的电子跃迁性质，较低能量的电子跃迁主要由HOMO→LUMO激发所贡献。

本研究成功开发了一类新型的二茂铁共轭双甲氧基苯基咪唑荧光团，它们在水性介质中表现出独特的AIE特性。这些荧光团能够高灵敏度、高选择性地检测H₂O₂，检测限达到纳摩尔级别。更重要的是，它们具有良好的生物相容性和细胞膜通透性，能够用于活细胞中H₂O₂的荧光成像检测。这项研究不仅为H₂O₂检测提供了一种新的工具，也为理解AIE机制在生物传感中的应用提供了重要见解，对活性氧相关疾病的研究具有重要的理论和实践意义。

该研究的创新之处在于巧妙结合了二茂铁的氧化还原活性和咪唑衍生物的AIE特性，构建了一种新型的"开启/关闭"型荧光探针。与以往报道的二茂铁基探针相比，本研究开发的荧光团在检测灵敏度、选择性和生物相容性方面均表现出明显优势。此外，研究还通过详细的机理研究，深入探讨了荧光团的光物理性质、电化学行为以及分子结构与性能之间的关系，为后续设计更高效的荧光探针提供了理论指导。

这项研究成果不仅推动了AIE材料在生物传感领域的应用，也为理解H₂O₂在生理和病理过程中的作用提供了新的研究工具，有望在疾病诊断、药物筛选和环境监测等领域发挥重要作用。未来，研究人员可以进一步优化分子结构，提高探针的性能，并探索其在其他生物活性分子检测中的应用潜力。