《Gut Microbes》：Peptidoglycan fromBifidobacterium adolescentisenhances IL-10 production in regulatory B cells to alleviate gut inflammation
编辑推荐：
本研究发现，源自健康人粪便的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）Bifi-94菌株，其细胞壁组分肽聚糖（PG）能通过Toll样受体2（TLR2）依赖性地激活ERK/p38 MAPK信号通路，特异性诱导调节性B细胞（Breg）产生白介素-10（IL-10），从而在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型中发挥抗炎作用。该效应在人类结肠B细胞中也得到验证，揭示了菌株特异性免疫调节的新机制。
Abstract
肠道菌群调节宿主免疫反应的机制尚未被完全阐明。本研究从健康个体粪便中分离出乳酸菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）菌株，旨在筛选能够抑制肠道炎症的共生菌。其中，青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis，Bifi-94）在体外能诱导单核细胞产生IL-10。向经葡聚糖硫酸钠（DSS）处理的小鼠口服Bifi-94可减轻体重下降并降低结肠炎症评分。在野生型C57BL/6小鼠中，Bifi-94提高了结肠组织匀浆中的IL-10水平，但并未改变调节性T细胞（Treg）的频率。相反，CD19+CD11b+调节性B细胞（Breg）成为IL-10的主要来源，其数量在腹腔（PEC）中经Bifi-94处理后显著增加。活的、热灭活的和福尔马林固定的Bifi-94均能强烈激活PEC细胞分泌IL-10。Bifi-94来源的肽聚糖（PG）选择性刺激了CD19+CD11b+Breg细胞产生IL-10，多组学分析显示，与标准菌株（Bifi-ST）相比，Bifi-94的PG生物合成酶（MurE, MurD, Alr, UppP）表达上调。机制上，Bifi-94来源的PG促进了Breg细胞中TLR2依赖的ERK和p38 MAPK信号通路的激活。值得注意的是，PG同样能增强人结肠组织来源的CD19+B细胞的IL-10产量。这些发现表明，Bifi-94来源的PG通过TLR2介导的信号通路促进Breg细胞产生IL-10，从而有助于缓解肠道炎症。
Introduction
人类胃肠道栖息着高度多样和动态的微生物生态系统，即肠道菌群，其在维持肠道稳态和调节宿主免疫中扮演核心角色。其中，乳酸菌和双歧杆菌物种因其促进健康的特性而被认可。这些共生菌被广泛认为是益生菌，可通过与上皮细胞和免疫细胞相互作用并产生一系列生物活性代谢物来调节免疫反应。此类微生物-免疫相互作用对于维持免疫耐受和防止过度炎症至关重要。
微生物来源的代谢物和细胞壁组分深刻影响宿主免疫。短链脂肪酸（SCFAs），如丁酸盐和丙酸盐，促进调节性T细胞（Treg）的分化，从而抑制效应T细胞反应。同样，色氨酸代谢物如吲哚-3-醛和吲哚丙烯酸有助于维持黏膜免疫和肠道屏障完整性。在细胞壁组分中，肽聚糖（PG）作为细菌细胞壁的关键结构成分，已成为一种有效的免疫调节因子。例如，源自唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）的PG通过促进CD103+调节性树突状细胞（DCs）和Treg细胞，以IL-10依赖的方式缓解结肠炎。此外，PG也被证明能抑制脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞中促炎细胞因子的产生，并通过PG亚基N-乙酰葡糖胺（GluNAc）增强Treg分化，同时抑制促炎性辅助T细胞1（Th1）和Th17细胞反应。源自PG的NOD2配体胞壁酰二肽（MDP）以及产生DL-内肽酶的唾液乳杆菌菌株可通过NOD2信号通路减轻DSS诱导的结肠炎。
IL-10是一种核心抗炎细胞因子，可调节免疫反应并在维持肠道屏障完整性方面发挥关键作用。多种免疫细胞类型，包括Foxp3+Treg细胞、巨噬细胞和B细胞，都能够产生IL-10。先前研究表明，肠道菌群可诱导免疫细胞产生IL-10，从而缓解肠道炎症。例如，丁酸梭菌（Clostridium butyricum）和脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）来源的多糖A（PSA）分别通过Toll样受体2（TLR2）依赖的信号通路增强巨噬细胞和Treg细胞的IL-10产生，最终有助于改善结肠炎。此外，结肠固有层中驻留的产IL-10 B细胞可由共生菌群诱导，并在抑制肠道炎症中发挥作用。尽管大量研究表明共生菌可促进IL-10产生并抑制炎症，但所涉及的微生物和宿主机制仍知之甚少。
虽然Treg细胞因其抗炎功能已被广泛认可，但越来越多的证据揭示了调节性B细胞（Breg）具有类似的免疫抑制功能。Breg细胞是一类特殊的B细胞亚群，主要通过产生IL-10来抑制免疫反应。这些产IL-10的Breg细胞通过抑制Th1和Th17细胞的分化以及减少细胞因子分泌来抑制炎症。已鉴定出几种表型不同的Breg亚群，包括B220low/midCD19+CD11b+细胞（B-1 B细胞）、CD19+TIM1+细胞（TIM1+B细胞）和CD19+CD5+CD1dhi细胞（B10细胞）。Breg细胞的保护作用已在多种小鼠免疫介导疾病模型中得到证实，包括结肠炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）和关节炎。尽管证据不断积累，但控制B细胞产生IL-10的分子机制仍有待完全阐明。
本研究调查了人源性青春双歧杆菌菌株的免疫调节特性，特别关注其调节免疫细胞功能和促进IL-10产生的能力。我们的研究结果表明，源自青春双歧杆菌的PG以TLR2依赖的方式显著增强Breg细胞的IL-10产生。此外，我们发现该PG也能刺激从人结肠组织分离的B细胞分泌IL-10。这些结果确定了青春双歧杆菌作为一种有效的免疫调节共生菌，并提示其在促进肠道炎症背景下抗炎反应方面的治疗潜力。
Results
Anti-inflammatory properties of B. adolescentis isolated from human feces
为了鉴定具有强效抗炎特性的共生菌，研究人员从健康人类供体的粪便中分离出多种乳酸菌和双歧杆菌菌株。利用脾细胞-细菌共培养系统对这些分离株进行筛选，以识别那些优先引发抗炎反应的菌株。研究重点聚焦于那些能强力促进IL-10产生同时最小化IL-12分泌的菌株，因为源自树突状细胞（DCs）的IL-12驱动炎症性Th1分化，而IL-10是抑制过度炎症的关键调节性细胞因子。大约15个菌株，包括Bifi-36、Bifi-85和Bifi-94，被鉴定为强效IL-10诱导剂，且IL-12产量极低。这些菌株被选用于后续的免疫调节活性评估。
Oral administration of B. adolescentis Bifi-94 ameliorates DSS-induced colitis
为了评估所选细菌菌株的体内抗炎潜力，研究人员采用了小鼠DSS诱导的结肠炎模型。小鼠每日口服PBS或候选菌株，持续两周，随后在饮用水中给予3.5% DSS 7天以诱导急性结肠炎。在测试的菌株中，与PBS、Bifi-36和Bifi-85组相比，口服青春双歧杆菌Bifi-94显著减轻了体重下降。Bifi-94处理还减轻了DSS诱导的结肠缩短，并且疾病活动指数（DAI）在Bifi-94处理的小鼠中显著降低。此外，组织学分析显示，与PBS处理的对照组相比，Bifi-94处理小鼠的结肠组织炎症评分显著降低。其余12个候选菌株在该模型中未显示出显著的保护作用。总之，这些发现表明，新分离的青春双歧杆菌Bifi-94是一种具有强效抗炎作用的有前景的共生菌。
Bifi-94 induces IL-10 production independently of CD4+Foxp3+T cells
为了确定哪些免疫细胞群体介导Bifi-94的抗炎作用，研究人员向野生型C57BL/6（B6）小鼠口服Bifi-94两周。正如预期，与PBS处理的对照组相比，Bifi-94处理显著提高了结肠和脾脏组织匀浆中的IL-10水平，而IL-12水平保持不变。由于CD4+Foxp3+Treg细胞是肠黏膜中主要的IL-10产生群体，研究人员接下来检查了Bifi-94是否影响其丰度。然而，这些组织中CD4+Foxp3+Treg细胞的频率保持不变。为了进一步评估Bifi-94是否影响Treg细胞分化，从野生型B6小鼠脾脏中分离出初始CD4+T细胞，并在Treg诱导条件下与活的Bifi-94共培养。在此条件下，Bifi-94对CD4+Foxp3+T细胞分化或IL-10产生没有影响。此外，分选的CD3+CD4+和CD3+CD4-脾细胞群在Bifi-94刺激下不产生IL-10。总之，这些发现表明Bifi-94通过不依赖于CD4+Foxp3+T细胞的机制增强IL-10产生。
B. adolescentis Bifi-94 induces IL-10 production in Breg cells
鉴于B细胞也能够产生IL-10，研究人员接下来分选了B220hi和B220low/mid细胞群，并在体外与Bifi-94共培养。值得注意的是，IL-10主要由B220low/mid亚群分泌。先前研究已鉴定B-1 B细胞——以B220low/mid、CD19+和CD11b+表达为特征——是强效的IL-10生产者。因此，研究人员从脾脏中分选了B220low/midCD19+细胞并与Bifi-94共培养，证实这些Breg细胞能强力产生IL-10。这些结果证明Bifi-94选择性诱导B220low/midCD19+Breg细胞产生IL-10。
由于Breg细胞在脾脏中相对稀少，研究人员接下来从脾脏、结肠、派尔集合淋巴结和腹腔（PEC）分离单核细胞，以鉴定富含该群体的组织。B220low/midCD19+Breg细胞在PEC中最为丰富，并且PEC来源的细胞在Bifi-94刺激下表现出最高的IL-10产量。当以1:1、1:5和1:10的细胞-细菌比率与Bifi-94共培养时，PEC细胞的IL-10产量呈剂量依赖性增加。当研究人员从PEC中分选B220low/mid和B220low/midCD19+细胞并用Bifi-94刺激时，两个群体都产生了IL-10。由于Breg细胞进一步以CD11b表达为特征，研究人员分离了CD11b+CD19+和B220low/midCD11b+CD19+亚群，并证实两者在Bifi-94刺激下均产生IL-10。
为了探索Bifi-94对其他Breg细胞亚型的影响，研究人员将Bifi-94与来自脾脏、结肠和PEC的单核细胞共培养。在脾细胞和PEC细胞中，Bifi-94增加了TIM1+B细胞的频率，而CD19+CD5+B细胞的频率保持不变。相反，结肠来源的单核细胞表现出CD19+CD5+B细胞的增加，而TIM1+B细胞没有变化。总之，这些发现表明Bifi-94选择性促进CD11b+CD19+Breg细胞中的IL-10产生，并能在不同组织区室中调节多个Breg亚群。
Oral administration of B. adolescentis Bifi-94 enhances IL-10 production by Breg cells
为了确定Bifi-94是否在体内促进Breg细胞产生IL-10，研究人员每日给野生型B6小鼠口服Bifi-94，持续4周。与PBS处理的对照组相比，Bifi-94处理的小鼠在PEC中CD11b+CD19+Breg细胞的频率和绝对数量均显著增加。值得注意的是，Bifi-94喂养小鼠PEC中产IL-10的Breg细胞数量显著高于对照组。类似地，Bifi-94处理小鼠脾脏中产IL-10 Breg细胞的频率也增加了。为了进一步评估体内暴露后的IL-10产生，研究人员从Bifi-94或PBS喂养小鼠的PEC中分离单核细胞，并在体外用Bifi-94再刺激72小时。与PBS处理小鼠相比，Bifi-94处理小鼠的PEC细胞在再刺激后表现出显著更高的IL-10分泌。总之，这些发现证明口服Bifi-94在体内增强了系统性（脾脏）和黏膜（PEC）免疫区室中CD11b+CD19+Breg细胞的丰度和IL-10产生能力。
B. adolescentis Bifi-94-derived PG enhanced IL-10 production by Breg cells
为了鉴定Bifi-94中负责刺激Breg细胞IL-10产生的效应组分，研究人员用活的、热灭活的或福尔马林固定的Bifi-94及其培养上清处理PEC细胞，并测量IL-10水平。热灭活和福尔马林固定的Bifi-94诱导的IL-10产量与活菌诱导的水平相当。这三种Bifi-94制剂（活的、热灭活的和固定的）刺激的IL-10分泌均显著高于标准菌株青春双歧杆菌KCTC3216（Bifi-ST）。相反，来自Bifi-94和Bifi-ST的培养上清诱导了相当的IL-10水平，表明分泌的代谢物不是观察到的效应的主要贡献者。
一致地，培养上清中的SCFA水平在两个菌株之间没有显著差异。为了研究细菌结构组分的作用，研究人员根据实验方案从Bifi-94中分离了粗制细菌组分。将PEC来源的单核细胞和纯化的CD11b+CD19+Breg细胞与沉淀的细菌组分共培养诱导了IL-10分泌。
基于这些发现，研究人员进一步从Bifi-94中纯化了蛋白质、荚膜多糖（CPS）、可溶性肽聚糖（SPG）和全肽聚糖（WPG），这些是已知能调节免疫反应的组分。当单核细胞和CD11b+CD19+Breg细胞与这些纯化组分共培养时，WPG是唯一能显著诱导IL-10产生的组分。研究人员随后严格评估了WPG制备物的纯度。通过比色法量化无机磷酸盐来评估磷壁酸（TA）污染，并通过共聚焦显微镜观察LTA来检查潜在的脂磷壁酸（LTA）污染。此外，通过用蛋白酶K处理WPG制备物来功能性测试可能的脂蛋白污染物。单核细胞的IL-10产量在WPG刺激下呈剂量依赖性增加。为了确定这种效应是否对Bifi-94特异，研究人员也从Bifi-ST中分离了WPG并测试其活性。有趣的是，来自Bifi-ST的WPG诱导的IL-10水平与来自Bifi-94的相当，表明PG本身是主要的效应分子。这些结果共同表明WPG是促进Breg细胞IL-10产生的关键细菌组分。
B. adolescentis Bifi-94 upregulates bacterial PG biosynthesis-related genes and proteins
为了研究Bifi-94相较于Bifi-ST菌株能更有效增强Breg细胞IL-10产生的机制，尽管从两菌株分离的WPGs诱导了相似的IL-10水平，研究人员进行了全基因组测序以分析Bifi-94的遗传特征。系统发育分析确认Bifi-94与Bifi-ST亲缘关系密切。用直系同源群（COGs）注释的Bifi-94完整基因组图谱显示，值得注意的是，COG功能注释揭示Bifi-94中细胞壁/膜/包膜生物发生簇的基因数量多于Bifi-ST。基于此观察，研究人员假设Bifi-94可能表现出增强的PG合成活性。为了验证这一点，研究人员检查了参与PG生物合成的基因表达，包括Mur酶家族。转录组学分析显示，与Bifi-ST相比，Bifi-94的PG合成相关基因（如murA, murC, murD, murE, murF, murG, uppP）表达更高。
为了评估这些转录组差异是否转化为蛋白质水平，研究人员进行了蛋白质组学分析。分别从Bifi-ST和Bifi-94鉴定出1215和1168种蛋白质。关键的PG合成相关蛋白，包括Alr、MurE、MurD和UppP，在Bifi-94中相对于Bifi-ST上调。在两个菌株中鉴定的差异上调蛋白，分别有133个来自Bifi-ST和104个来自Bifi-94，进行了京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。值得注意的是，Bifi-94中有4个蛋白质，Bifi-ST中有1个蛋白质与PG生物合成通路（ko00550）相关，表明该通路在Bifi-94中存在菌株特异性富集。为了进一步支持这些发现，研究人员从两个菌株分离并量化了PG。Bifi-94中的PG量有高于Bifi-ST的趋势。总之，这些结果表明Bifi-94表现出增强的PG生物合成能力，这可能是其优越的刺激Breg细胞IL-10产生能力的基础。
B. adolescentis Bifi-94-derived PG induced IL-10 production by Breg cells in a TLR2-dependent manner
鉴于TLR2在识别PG和启动下游免疫反应中起关键作用，研究人员检查了Bifi-94诱导的Breg细胞IL-10产生是否依赖于TLR2信号。PEC来源的单核细胞和CD11b+CD19+Breg细胞在用Bifi-94刺激前用TLR2拮抗剂处理。值得注意的是，TLR2抑制显著降低了单核细胞中的IL-10产生，并几乎完全消除了纯化Breg细胞中的IL-10分泌，表明TLR2信号在Bifi-94诱导的IL-10反应中起核心作用。一致地，在相同条件下，用作阳性对照的TLR2激动剂Pam3CSK4诱导的IL-10产生也被TLR2拮抗剂有效抑制，证实了该系统中TLR2的有效阻断。先前研究表明，TLR2下游的ERK和p38 MAPK通路的激活促进巨噬细胞和DCs中的IL-10产生。
为了确定这些通路是否也参与Bifi-94介导的Breg细胞活化，研究人员检测了用全菌Bifi-94和纯化WPG刺激的PEC来源单核细胞中ERK和p38的磷酸化。Bifi-94和Bifi-94来源的WPG都强烈激活了ERK和p38磷酸化。重要的是，用TLR2拮抗剂预处理完全抑制了这种激活，证实了ERK和p38通路是在响应Bifi-94及其WPG组分时，于TLR2下游被激活的。总之，这些发现证明源自Bifi-94的WPG通过TLR2依赖的ERK和p38 MAPK信号通路激活刺激CD11b+CD19+Breg细胞产生IL-10。
B. adolescentis Bifi-94 induces IL-10 production by B cells in the human gut
为了确定人肠道中是否存在产IL-10的B细胞，研究人员分析了公开可用的单细胞RNA测序（scRNA-seq
