《Research》：SENP6 Restrains NLRP3 Inflammasome Activation via DeSUMOylation-Driven K48-Linked Ubiquitination of NLRP3 in Acute Lung Injury
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本研究聚焦NLRP3炎症小体过度活化引发的炎症性疾病治疗难题。研究人员深入探讨了去SUMO化酶SENP6对NLRP3炎症小体活化的调控作用及分子机制。结果揭示，SENP6通过其酶活性直接结合NLRP3，特异性去除其K23、K204和K689位点的SUMO2/3修饰，进而招募E3泛素连接酶MARCHF7，促进NLRP3发生K48连锁的多聚泛素化，最终通过自噬-溶酶体途径降解NLRP3蛋白，负向调控其活化。该发现阐明了SUMO化与泛素化交叉对话调控NLRP3稳定性的新机制，为相关炎症性疾病的靶向治疗提供了新思路和潜在靶点。
在人体免疫防御的前线，先天免疫系统如同一位高度警惕的哨兵，其核心组成部分之一——NLRP3炎症小体（NLRP3 Inflammasome），在感知病原体入侵和细胞损伤信号时发挥着至关重要的作用。当NLRP3炎症小体被激活，它会催化 caspase-1 的活化，进而促使促炎细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-18成熟并释放，启动炎症反应以清除威胁。然而，这把“双刃剑”若调控失常，过度活化的NLRP3炎症小体则与多种重大疾病的发生发展密切相关，包括自身免疫性疾病、癌症、呼吸系统疾病、心血管功能障碍、神经退行性病变以及代谢综合征等。其中，急性肺损伤（Acute Lung Injury, ALI）作为一种以呼吸窘迫和难治性低氧血症为特征的危重病症，具有高发病率和高死亡率，NLRP3炎症小体的过度活化是其进展的关键推手，会加剧炎症反应，恶化病情。因此，精确调控NLRP3炎症小体的活性，对于遏制过度炎症、防止组织损伤至关重要。
NLRP3炎症小体的活性受到精密的多层次调控，其中转录后修饰（Posttranslational Modifications, PTMs）扮演着核心角色。如同给蛋白质贴上各种功能“标签”，泛素化（Ubiquitination）、SUMO化（SUMOylation）等动态可逆的修饰方式，共同调控着NLRP3蛋白的稳定性、亚细胞定位和活化状态。细胞内NLRP3蛋白的丰度被认为是炎症小体活化的限速步骤之一。前期研究表明，SUMO化修饰对NLRP3的稳定性与活性具有重要影响，例如E3 SUMO连接酶TRIM28通过促进NLRP3的SUMO化，抑制其K48连锁的泛素化降解，从而增强NLRP3稳定性，促进炎症小体活化。然而，SUMO化修饰的动态移除——即去SUMO化过程，由其特异性蛋白酶SENP（Sentrin/SUMO-specific protease）家族执行，它们在NLRP3炎症小体调控中的作用，特别是SENP6的具体功能及其机制，尚不清晰，甚至存在争议。有研究指出SENP6/SENP7通过去SUMO化NLRP3促进炎症小体活化，这提示SUMO化修饰调控的复杂性。因此，深入揭示SENP6在NLRP3炎症小体活化中的确切作用及分子机制，不仅有助于理解炎症小体活化的精细调控网络，也可能为相关疾病提供新的治疗策略。
为了回答上述问题，研究人员在《Research》上发表论文，系统深入地探讨了SENP6在NLRP3炎症小体活化中的负向调控作用及机制。研究发现，在NLRP3炎症小体活化过程中，SENP6的表达会上调。功能缺失实验表明，巨噬细胞中SENP6的缺失会显著增强NLRP3炎症小体的活化，具体表现为caspase-1切割增加、IL-1β和IL-18分泌增多、细胞焦亡（pyroptosis）加剧以及ASC寡聚化和斑点形成增强。机制上，SENP6通过其Peptidase1结构域直接与NLRP3的PYD和NACHT结构域相互作用。SENP6发挥其去SUMO化酶活性，特异性去除NLRP3蛋白K23、K204和K689位点上的SUMO2/3链修饰。这一去SUMO化过程为E3泛素连接酶MARCHF7的招募创造了条件，进而促进NLRP3发生K48连锁的多聚泛素化，最终通过自噬-溶酶体途径导致NLRP3蛋白降解，从而负调控其炎症小体活化。在体实验进一步证实，髓系细胞特异性敲除SENP6会加重脂多糖（LPS）诱导的内毒素休克相关急性肺损伤以及明矾（alum）诱导的腹膜炎模型中的炎症反应。该研究揭示了SENP6通过介导去SUMO化与K48连锁泛素化的交叉对话，进而促进NLRP3降解的新机制，确立了SENP6作为NLRP3炎症小体活化的关键负调控因子，为炎症性疾病的治疗提供了新的潜在靶点。
研究人员为开展此项研究，综合运用了多种关键技术方法。在细胞模型方面，使用了小鼠肺泡巨噬细胞系（MH-S）、小鼠原代腹腔巨噬细胞（PMs）以及人单核细胞系THP-1分化的巨噬细胞进行体外功能验证和机制探索。利用RNA干扰技术和髓系细胞特异性SENP6基因敲除小鼠（SENP6fl/flLyz2-cre）构建基因缺陷模型，并通过质粒转染进行基因回补实验。在分子机制层面，采用了免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, CO-IP）和免疫荧光技术分析蛋白质相互作用和亚细胞定位；通过体外泛素化/去SUMO化分析、点突变技术和蛋白质稳定性检测（如放线菌酮CHX追踪实验）探究翻译后修饰的动态变化及降解途径（使用蛋白酶体抑制剂MG132、carfilzomib和自噬-溶酶体抑制剂氯喹CQ、3-甲基腺嘌呤3-MA）；利用抑制剂（如ERK抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125）干预信号通路。在动物模型方面，构建了LPS诱导的内毒素休克急性肺损伤模型和明矾诱导的腹膜炎模型，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、乳酸脱氢酶（LDH）检测、组织病理学分析（H&E染色）、肺组织湿重/干重（W/D）比测定、支气管肺泡灌洗液（BALF）分析以及免疫印迹（Western Blot）等技术评估体内炎症反应程度和分子变化。
SENP6在NLRP3炎症小体活化过程中上调
研究人员首先评估了在NLRP3炎症小体活化过程中SENP6的表达变化。发现在LPS和ATP刺激下，不同类型巨噬细胞（MH-S、PMs、THP-1来源巨噬细胞）中SENP6表达均上调。在体实验也证实，腹腔注射LPS后，野生型小鼠肺组织中SENP6表达显著增加。这表明SENP6作为重要的去SUMO化酶，与NLRP3炎症小体活化密切相关。
SENP6缺陷促进NLRP3炎症小体活化
为了探究SENP6的功能，研究者在MH-S细胞中敲低SENP6，并在SENP6髓系特异性敲除小鼠的原代PMs中进行验证。结果显示，SENP6缺陷显著增强了LPS预刺激后由ATP或尼日利亚霉素（nigericin）诱导的NLRP3炎症小体活化，表现为caspase-1切割、IL-1β和IL-18分泌、LDH释放以及ASC寡聚化和斑点形成均增加，但对TNF-α分泌无影响，且对AIM2炎症小体活化也无明显效应。这表明SENP6缺陷特异性且强力地放大了NLRP3炎症小体的活化。
SENP6与NLRP3相互作用
机制探索发现，SENP6在体外和细胞内均能特异性与NLRP3相互作用，而不与caspase-1或ASC结合。NLRP3炎症小体激活剂ATP处理增强了SENP6与NLRP3的相互作用和共定位。通过结构域分析，确定SENP6通过其Peptidase1结构域与NLRP3的PYD和NACHT结构域结合。
SENP6促进NLRP3的自噬降解
鉴于SENP6对NLRP3炎症小体的负调控作用及其直接相互作用，研究者推测SENP6可能调控NLRP3蛋白表达。实验证实，过表达SENP6能降低NLRP3蛋白水平而不影响其mRNA水平，且不影响CASP1和PYCARD蛋白表达。相反，敲低或敲除SENP6则显著提高NLRP3蛋白水平。蛋白质稳定性实验表明SENP6缺失延缓了NLRP3的降解。进一步利用抑制剂发现，自噬-溶酶体途径抑制剂（氯喹CQ、3-甲基腺嘌呤3-MA）能抑制SENP6诱导的NLRP3降解，而蛋白酶体抑制剂（MG132、carfilzomib）无此作用，表明SENP6主要通过自噬-溶酶体途径促进NLRP3降解。
SENP6增强NLRP3的K48连锁泛素化
研究表明，SENP6的酶活性（关键位点C1030）对其促进NLRP3降解至关重要。过表达SENP6能显著增强NLRP3的多聚泛素化，且此作用依赖于其酶活性。通过使用特定连接类型的泛素突变体，证实SENP6特异性促进NLRP3的K48连锁多聚泛素化。
SENP6招募MARCHF7以促进NLRP3的K48连锁泛素化
由于SENP6本身无泛素连接酶活性，研究者推测其可能通过招募E3连接酶发挥作用。在已知能泛素化NLRP3的E3连接酶中，MARCHF7因能促进K48连锁泛素化并导致自噬降解而引起关注。实验证实SENP6与MARCHF7存在相互作用。敲低MARCHF7或使其酶活性失活（W589A/I556A突变），均能废除SENP6介导的NLRP3 K48连锁泛素化和降解。SENP6的过表达或缺失能相应增强或减弱MARCHF7与NLRP3的相互作用，且SENP6对于MARCHF7介导的NLRP3泛素化和降解是必需的。这些结果说明SENP6通过招募MARCHF7来促进NLRP3的K48连锁多聚泛素化和降解。
SENP6介导NLRP3在K23、K204和K689位点的去SUMO化
作为去SUMO化酶，SENP6特异性去除NLRP3上的SUMO2/3修饰，而非SUMO1修饰。通过生物信息学预测和点突变实验，鉴定出K23、K204和K689是SENP6介导NLRP3去SUMO化的关键位点。突变这些位点会废除SENP6对NLRP3的去SUMO化作用及其促进降解的能力。
SENP6缺陷促进NLRP3依赖性炎症
在体功能上，髓系细胞特异性SENP6敲除小鼠在LPS诱导的内毒素休克模型中，血清和BALF中IL-1β和IL-18水平显著升高，死亡率增加，肺组织损伤加重（表现为W/D比升高、炎症细胞浸润），肺组织中NLRP3蛋白水平上调而mRNA水平不变。在明矾诱导的腹膜炎模型和气管内滴注LPS诱导的急性肺损伤模型中，SENP6缺陷同样加剧了NLRP3依赖的炎症反应。这些结果确证了SENP6在体内负调控NLRP3炎症小体活化及相关炎症性疾病的作用。
本研究揭示了SENP6通过精细的分子机制负向调控NLRP3炎症小体活化的新通路。SENP6在炎症小体活化过程中表达上调，通过直接结合NLRP3，特异性去除其K23、K204和K689位点的SUMO2/3修饰。这一去SUMO化事件为招募E3泛素连接酶MARCHF7创造了条件，进而促进NLRP3发生K48连锁的多聚泛素化，最终通过自噬-溶酶体途径导致NLRP3蛋白降解，从而限制其过度活化。研究发现SENP6缺陷在体外和体内均显著增强NLRP3炎症小体活化并加重相关炎症模型的表现。
该研究的创新性和重要意义在于：首先，它阐明了一种由SENP6介导的、连接去SUMO化与K48连锁泛素化的交叉对话机制，该机制通过调控NLRP3蛋白稳定性来限制炎症小体活化，这为理解炎症小体的精密调控网络增添了新的重要环节。其次，研究明确了SENP6作用的特异性SUMO化位点（K23, K204, K689）以及其依赖的E3连接酶（MARCHF7），并揭示了其促进降解的具体途径（自噬-溶酶体途径），机制阐述较为深入。再者，研究结果在一定程度上澄清了关于SENP6在NLRP3炎症小体活化中作用的争议，强调了其在负向调控中的关键角色，并通过多种体内外模型提供了有力证据。最后，该研究鉴定SENP6为NLRP3炎症小体活化的关键负调控因子，为开发针对NLRP3驱动的大量炎症性疾病（如急性肺损伤、腹膜炎等）的新型治疗策略（例如，基于靶向蛋白降解技术如PROTACs的策略）提供了潜在的分子靶点和理论依据。
