《Microbiology Spectrum》：Influenza pneumonia mice under different immune conditions: changes in pulmonary microbiota and metabolites
ABSTRACT
肺炎是流感病毒感染最常见的并发症，在免疫低下个体中死亡率极高。当前疫苗接种和抗病毒治疗均未取得满意疗效。与其他器官不同，由于持续暴露于空气颗粒物和病原体，肺部拥有独特的微生物群落。然而，流感肺炎中肺微生物群及其代谢产物的特征性改变，及其与免疫抑制的潜在关联，仍未得到充分研究。本研究通过注射免疫抑制剂环磷酰胺构建免疫抑制小鼠模型，并在免疫正常和免疫抑制两种状态下建立流感肺炎模型。常规监测体重，并通过苏木精-伊红染色评估肺组织病理学变化。分别采用RT-qPCR、酶联免疫吸附测定、16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学分析肺组织病毒载量、血清炎症细胞因子水平、肺微生物群组成和肺代谢物。采用Spearman相关分析评估肺微生物类群与特定代谢物之间的显著关联。
结果显示，流感病毒感染导致小鼠体重显著下降，肺组织病毒载量显著增加，血清炎症细胞因子水平升高。这些效应在免疫抑制小鼠中更为明显，其肺组织也表现出更严重的炎症和病理变化。在免疫抑制流感肺炎模型中观察到肺微生物群的特征性转变，特别是Bacteroides和Agathobacter的丰度增加。此外，关键代谢物如腺苷、腺苷5′-单磷酸和黄嘌呤发生显著改变，表明嘌呤代谢通路受到扰动。研究表明，免疫抑制下的流感肺炎会导致更严重的炎症和病理性肺损伤。观察到的肺微生物群及相关代谢物的特征性变化，为理解免疫低下个体流感病毒感染后严重肺损伤的发病机制提供了潜在的微生物和代谢靶点。
INTRODUCTION
甲型流感病毒（IAV）感染通常引起发热、流涕、咽痛、咳嗽和乏力等症状。全球每年估计有数十万人死于流感相关呼吸道并发症，其中肺炎最为常见。老年人、幼儿、孕妇和免疫功能低下患者感染IAV后尤其易发展为肺炎，显著增加死亡风险。当前主要预防和治疗策略包括疫苗接种和抗病毒治疗，但由于病毒株频繁的抗原漂移和转换，疫苗需定期更新。抗病毒药物虽可减轻流感及其并发症的严重程度和持续时间，但需在感染早期使用，且可能导致耐药病毒株的出现。因此，亟需开发新的治疗策略。
宿主免疫反应在流感发病机制中起关键作用。环磷酰胺是一种具有骨髓抑制活性的烷化剂，可破坏DNA复制、诱导细胞凋亡、降低NK细胞活性并抑制T细胞和B细胞增殖，从而创建免疫抑制状态。它被广泛用于建立小鼠免疫抑制模型，包括流感病毒感染模型。在一定剂量下腹腔注射可增加小鼠对病毒感染的易感性，加重致病性，导致更严重的肺炎甚至肺外受累。本研究首先使用环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，随后通过鼻内感染流感病毒，模拟免疫功能低下人群感染IAV，旨在探索免疫状态如何影响流感相关肺炎的发生和发展。
由于其独特的氧气和空气颗粒物暴露环境，肺部的微生物群落与其他器官显著不同。外部环境刺激可改变肺微生物群的组成，进而影响呼吸道疾病的发展和预后，并导致其代谢物改变。本研究采用16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学技术，研究不同免疫抑制状态下流感感染小鼠模型肺微生物群组成和代谢谱的变化，旨在进一步阐明免疫抑制宿主流感肺炎肺病理的潜在机制，为发现新的治疗靶点提供理论见解和实验证据。
MATERIALS AND METHODS
Animals
使用40只BALB/c小鼠，雌雄各半，饲养于标准环境。
Influenza A virus
使用鼠适应IAV毒株，通过鸡胚尿囊腔接种法扩增病毒。
Reagents and chemicals
包括环磷酰胺、细胞因子ELISA检测试剂盒、RNA提取试剂盒、qPCR相关试剂等。
Establishment of an animal model
小鼠随机分为四组：Vehicle/Mock组、Vehicle/IAV组、Cyclo/Mock组和Cyclo/IAV组。Cyclo组小鼠腹腔注射环磷酰胺，Vehicle组注射等量生理盐水。24小时后，IAV组小鼠鼻内接种流感病毒溶液。感染后第5天采集血液和肺组织样本。
Body weight measurement and RT-qPCR detection of influenza virus nucleoprotein mRNA expression in lung tissue
监测体重变化。随机选取每组4个样本，提取肺组织总RNA，通过RT-qPCR检测病毒核蛋白mRNA表达水平，以β-actin作为内参。
Analysis of the hematoxylin and eosin staining of the lungs
肺组织经固定、脱水、包埋、切片后行H&E染色，显微镜下观察组织病理学变化并进行损伤评分。
Enzyme-linked immunosorbent assay
使用ELISA试剂盒检测血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度。
16S rRNA gene sequencing
每组选取4个肺组织样本提取DNA，对16S rRNA基因V4区进行PCR扩增，建库后在NovaSeq 6000平台上进行测序。
Untargeted metabolomics analysis
Sample preparation
肺组织匀浆后，用预冷的80%甲醇提取代谢物，经离心后取上清液进行UPLC-MS/MS分析。
Chromatographic and mass spectrometric conditions
采用UHPLC系统与质谱联用，分别在正负离子模式下进行色谱分离和质谱检测。
Data preprocessing and analysis
使用Compound Discoverer软件进行峰提取和定量，通过KEGG、HMDB等数据库进行代>谢物注释。采用PLS-DA和OPLS-DA等多变量分析方法筛选差异代谢物。
Statistical analysis
使用SPSS软件进行统计分析。符合正态分布的数据采用单因素方差分析，非正态分布数据采用Kruskal-Wallis秩和检验。
RESULTS
Body weight and histopathological changes in lung tissues
与Vehicle/Mock组相比，Vehicle/IAV和Cyclo/IAV组小鼠体重显著下降，且Cyclo/IAV组体重低于Vehicle/IAV组。感染后第5天，Cyclo/IAV组肺组织病毒载量显著高于Vehicle/IAV组。H&E染色显示，Vehicle/IAV和Cyclo/IAV组肺组织出现肺泡壁增厚、炎性细胞浸润和红细胞渗出等病理改变，且Cyclo/IAV组病变更严重。
Expression levels of serum cytokines
ELISA结果显示，与Vehicle/Mock组相比，Vehicle/IAV和Cyclo/IAV组血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著升高。与Vehicle/IAV组相比，Cyclo/IAV组的IL-1β和TNF-α水平更高。表明免疫抑制加剧了流感感染小鼠的全身炎症反应。
Changes in pulmonary microbiota
Diversity analysis
稀释曲线表明测序深度足够。α多样性分析显示各组的物种丰富度和均匀度无显著统计学差异。β多样性分析（PCoA和NMDS）表明，病毒感染显著改变了免疫正常和免疫抑制小鼠的肺微生物群结构。
Changes in the relative abundance of the microbiota
在门水平，Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes是优势菌门。与Vehicle/Mock组相比，其他组的Firmicutes和Bacteroidetes相对丰度降低，而Proteobacteria丰度增加。在属水平，肺微生物群主要由Bacteroides、Pseudoalteromonas等组成。
Metastat分析显示，与Vehicle/Mock组相比，Vehicle/IAV组有29个属发生显著变化，例如Streptococcus丰度增加，而Alistipes和Lachnospiraceae_NK4A136_group丰度下降。比较Cyclo/IAV与Cyclo/Mock组，在属水平上，Cyclo/IAV组的Bacteroides、Agathobacter等8个属的丰度显著降低，而Ruminococcus和Uruburuella丰度增加。
LEfSe分析确定了各组间的差异类群作为潜在生物标志物。在Vehicle/IAV与Vehicle/Mock比较中，Streptococcus是Vehicle/IAV组的生物标志物，而Lachnospiraceae_NK4A136_group和Alistipes是Vehicle/Mock组的生物标志物。在Cyclo/IAV与Cyclo/Mock比较中，Agathobacter和Delftia被确定为Cyclo/Mock组的生物标志物。
Spearman相关分析显示，肺微生物组成和丰度的变化与炎症标志物水平密切相关。
Analysis of differential metabolites in the lung
质控分析表明数据质量良好。OPLS-DA模型显示各组间代谢物聚类明显。模型验证表明模型稳健未过拟合。筛选标准下，Vehicle/IAV vs Vehicle/Mock组鉴定出296个差异代谢物，Cyclo/IAV vs Cyclo/Mock组鉴定出149个差异代谢物。对Cyclo/IAV组特有的57个代谢物进行富集分析，发现它们主要富集在嘌呤代谢和苯丙氨酸代谢通路。值得注意的是，腺苷、2′-脱氧肌苷、脱氧鸟苷等嘌呤代谢物显著上调。
相关性热图显示，差异微生物属与差异代谢物之间存在广泛的相互作用。例如，Agathobacter丰度与多种脂质相关代谢物呈正相关。Bacteroides丰度与嘌呤代谢相关化合物如腺苷5′-单磷酸呈显著负相关，而与黄嘌呤等呈正相关。嘌呤代谢物与大多数细菌属显著相关。
DISCUSSION
与其他部位相比，肺微生物组和代谢组的研究尚处于起步阶段。肺部通过咳嗽、肺泡巨噬细胞清除、粘膜纤毛运动和肺表面活性物质的抗菌特性等多种选择机制，维持微生物组成和代谢物的动态平衡。研究表明，肺部微生物定植与清除之间的失衡可能与免疫功能和代谢过程有关，从而促进肺部疾病的发生发展。
宿主免疫反应影响流感肺炎的发病机制和临床预后。环磷酰胺诱导的免疫功能障碍优先消耗增殖的淋巴细胞，特别是CD4+/CD8+T细胞和调节性T细胞。CD4+/CD8+T细胞的耗损会损害免疫调节，延迟病毒清除。Tregs的耗损则解除了对先天免疫过度激活的抑制，导致IL-1β、TNF-α和IL-6等细胞因子不受控地产生。同时，环磷酰胺会破坏肠道微生物群，改变宿主代谢稳态，这些微生物群衍生的扰动可通过肠-肺轴进一步放大肺部的全身炎症反应。
本研究证实，与免疫正常的流感感染相比，免疫抑制下的流感病毒感染引起了更强的全身炎症反应，小鼠肺部表现出更严重的免疫病理损伤。更重要的是，流感病毒感染导致不同免疫状态小鼠的肺微生物群组成发生显著改变。在免疫抑制小鼠中，观察到的加剧的病理损伤可能归因于独特的微生物群结构变化和相关代谢改变，这超出了病毒感染单独引起的影响。
微生物群分析发现，免疫抑制流感肺炎小鼠肺部Bacteroides和Agathobacter的丰度显著降低，且这种降低与炎症细胞因子呈显著负相关。Bacteroides和Agathobacter都能产生短链脂肪酸，在维持肠道稳态和免疫功能中起重要作用。它们丰度的降低可能促进免疫低下人群炎症细胞因子的过度释放，导致比免疫功能正常者更严重的免疫病理损伤。
代谢组学分析发现，Cyclo/IAV组的差异代谢物主要富集于嘌呤代谢、不饱和脂肪酸生物合成和磷酸戊糖途径。其中，57个特异性代谢物主要富集在嘌呤代谢通路。注释到的8个差异表达的嘌呤代谢物中，有6个显著增加。已有研究报道流感感染后患者血清或细胞模型中嘌呤代谢物发生持续改变。本研究中腺苷5′-单磷酸呈下降趋势，与某些研究结果一致。这表明嘌呤代谢与免疫抑制状态下的流感肺炎显著相关，调节嘌呤代谢途径可能改善严重的肺病理损伤。
微生物组学与代谢组学的关联分析揭示了免疫抑制流感肺炎小鼠肺部中的核心菌属，如Bacteroides、Agathobacter等，这些菌属与脂肪酸代谢物、氨基酸代谢物以及差异表达的嘌呤代谢物显著相关。这表明特定的嘌呤代谢物可能作为生物标志物，表征免疫抑制流感肺炎中改变的代谢表型，并通过一系列信号效应影响宿主的生理功能。
总结而言，本研究通过16S rRNA测序和代谢组学分析，揭示了免疫抑制小鼠流感肺炎模型中肺微生物群及其相关代谢物的特征性改变，为理解免疫低下个体流感病毒感染后严重肺损伤的机制提供了微生物和代谢相关的潜在靶点。
展望未来，环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型是一种模拟宿主免疫力受损的人工方法，存在固有局限性。尽管它被广泛用于研究严重流感感染的易感性和抗病毒药物评估，但不能完全重现老年人中观察到的多因素免疫衰老。未来的研究将纳入老年小鼠模型，以进一步验证我们的观察结果并增强与人类生理的相关性。需要进一步研究阐明免疫抑制条件下流感肺炎影响肠道微生物群的具体调控机制，包括对特定细菌群落的直接和间接影响，以及这些微生物变化与宿主免疫反应和代谢状态的相互作用。未来采用微生物群移植作为辅助方法的研究，有望揭示微生物改变在流感肺炎中的机制作用，并为临床干预提供新见解。
ACKNOWLEDGMENTS
本研究得到了国家自然科学基金和湖南省自然科学基金的资助。
