三疣梭子蟹抗副溶血弧菌全基因组关联分析揭示AHNPD抗性多基因结构

《Aquaculture Reports》：Genome-wide association study for Vibrio parahaemolyticus resistance in the swimming crab Portunus trituberculatus

本研究针对三疣梭子蟹急性肝胰腺坏死病(AHPND)防控难题，通过全基因组关联分析(GWAS)解析其抗病遗传基础。研究人员对298只蟹进行副溶血弧菌攻毒实验，基于全基因组重测序(WGS)鉴定出395.5万高质量SNP，估计抗性遗传力为0.10，发现5个显著性SNP并筛选出IAP、Sf3a3等关键免疫基因，为抗病育种提供重要理论依据。

　　

在中国的水产养殖业中，三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）占据着重要的经济地位。然而，随着养殖规模的扩大和环境条件的恶化，疾病暴发日益频繁，其中由副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）引起的急性肝胰腺坏死病（Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND）给该产业带来了巨大的经济损失。这种携带特定质粒（pAP1）的强毒力菌株能导致养殖蟹类大规模死亡，严重威胁产业的可持续发展。面对这一挑战，通过遗传育种手段提升蟹类的内在抗病能力，被视为一种从根本上解决问题的有效策略。但与许多水生生物一样，对细菌性疾病的抗性通常表现为低至中等的遗传力，且其遗传基础复杂，涉及多个基因位点。因此，深入解析三疣梭子蟹抗AHPND的遗传机制，对于培育抗病新品种、保障产业稳定发展具有迫切的理论和实践意义。相关研究成果已发表在《Aquaculture Reports》上。

为揭示三疣梭子蟹抗AHPND的遗传基础，研究人员开展了一项整合基因组学与转录组学的综合性研究。研究的关键技术方法主要包括：首先，对来自选育群体“黄选1号”F₁₇代的298只三疣梭子蟹进行副溶血弧菌攻毒实验，并以生存时间作为抗性表型指标。其次，利用Illumina NovaSeq平台对全部个体进行平均深度约15.91×的全基因组重测序（WGS），经过严格质控后获得395.5万个高质量单核苷酸多态性（SNP）用于后续分析。接着，利用GCTA软件进行群体结构（主成分分析PCA和亲缘关系分析）和连锁不平衡（LD）衰减分析，并采用基于基因组关系的限制性最大似然法（GREML）估算抗性遗传力。最后，运用混合线性模型（GEMMA软件）进行全基因组关联分析（GWAS），筛选与抗性显著相关的SNP，并整合已发表的感染后肝胰腺组织转录组数据（差异表达基因分析，DEGs）来共同鉴定候选基因。

3.1. 测序与基因分型

研究人员对298只三疣梭子蟹进行了全基因组重测序，经过质控后获得了覆盖度约为15.91×的高质量数据。共鉴定出395.5万个高质量SNP，这些SNP在53条染色体上分布不均，例如Chr15和Chr30显示出较高的SNP密度，为后续的GWAS分析提供了高密度的全基因组标记。

3.2. 群体结构与连锁不平衡（LD）

亲缘关系分析和主成分分析（PCA）显示实验群体存在一定的遗传分化，前三个主成分分别解释了6.34%、6.07%和4.69%的遗传方差。连锁不平衡分析表明，三疣梭子蟹基因组中的LD衰减非常迅速，r²值在约3 kb的距离内即衰减至0.1，这提示其基因组重组率较高，也意味着GWAS需要更高的标记密度来有效定位关联信号。

3.3. 遗传力估计与全基因组关联研究

基于生存时间表型，研究人员估算出三疣梭子蟹对AHPND抗性的遗传力为0.10 ± 0.08，属于低遗传力性状，且估计值的标准误较大，反映了样本量有限和群体遗传异质性可能带来的不确定性。GWAS分析在建议显著性水平上鉴定出5个与抗性相关的SNP，它们分别位于Chr23、Chr17、Chr9、Chr31和Chr12上。这些SNP的表型方差解释率（PVE）均不高，在2.75%至2.99%之间，且其等位基因效应值为负，表明次要等位基因与较短的生存时间（即较低的抗性）相关。这进一步证实了AHPND抗性是一个由多个微效基因控制的多基因性状。

3.4. 基因表达分析与肝胰腺中的候选基因

通过整合GWAS结果和已发表的肝胰腺组织在副溶血弧菌感染后不同时间点（12-72小时）的转录组数据，研究人员发现GWAS筛选出的候选基因区域（显著SNP上下游20 kb）内共包含12个基因，其中IAP（凋亡抑制蛋白）、Sf3a3（剪接因子3A）和evm.TU.Chr23.301这三个基因在差异表达基因（DEGs）中也存在，表明它们可能在抗病免疫反应中扮演重要角色。热图显示IAP基因在感染72小时后的表达量显著上调。

研究的讨论部分对上述发现进行了深入分析。低遗传力估计和多个微效SNP的发现，共同支持了三疣梭子蟹AHPND抗性具有多基因遗传架构的结论。这与在其他水产动物（如凡纳滨对虾对抗AHPND）中的研究结果一致。对于此类复杂性状，传统的基于少数几个标记的标记辅助选择（MAS）效率有限，而基因组选择（GS）利用全基因组标记信息进行育种值预测，是更为有效的遗传改良策略。通过GWAS与转录组数据的整合分析，成功将候选基因范围缩小至IAP、Sf3a3和evm.TU.Chr23.301。IAP基因作为关键的凋亡调控因子，在贝类等无脊椎动物的免疫防御中作用明确，其表达上调可能有助于抑制病原菌诱导的细胞凋亡，从而增强宿主存活能力。然而，Sf3a3（参与RNA剪接）和evm.TU.Chr23.301（功能未知）在蟹类抗病免疫中的具体功能尚不清楚，需要后续的功能验证实验（如RNA干扰、基因编辑等）来确认。

综上所述，本研究首次在三疣梭子蟹中开展了针对AHPND抗性的全基因组关联分析，揭示了该性状的低遗传力和多基因本质。虽然发现的单个SNP效应较小，但研究筛选出的候选基因为理解其抗病分子机制提供了重要线索。这些结果不仅深化了对甲壳类动物抗病遗传基础的认识，而且为三疣梭子蟹抗AHPND的基因组选择育种计划的制定奠定了坚实的理论基础，对推动其养殖业的健康可持续发展具有重要意义。