性行为和发情期会影响恐惧消退过程中的功能连接性

《Behavioural Brain Research》：Sex and estrous phase influence functional connectivity during fear extinction

恐惧消退的性别和性周期阶段依赖性机制研究。雌性大鼠在动情前期和动情期进行恐惧消退训练，表现出更强的消退记忆和更少的恐惧复发，这依赖于中脑黑质-外侧纹状体多巴胺通路激活。研究证实动情前期雌性在腹侧被盖区多巴胺神经元cFos表达量显著高于其他组，DLS作为功能网络枢纽连接了前额叶皮层、海马及杏仁核等传统恐惧消退脑区，且性周期通过调控中脑去甲肾上腺素系统和多巴胺能神经环路动态影响消退记忆稳定性。

　　

艾丽莎·A·霍霍斯特（Alyssa A. Hohorst）| 杰西卡·D·韦斯特曼（Jessica D. Westerman）| 卡罗莱纳·桑切斯-门多萨（Carolina Sanchez-Mendoza）| 玛格丽特·K·坦纳（Margaret K. Tanner）| 迈尔斯·Q·德莱登（Miles Q. Dryden）| 朱丽叶·R·弗伦德（Juliet R. Freund）| 雷姆拉·A·阿卜杜尔（Remla A. Abdul）| 凯文·M·克罗姆比（Kevin M. Crombie）| 本杰明·N·格林伍德（Benjamin N. Greenwood）

美国科罗拉多大学丹佛分校综合生物学系，邮政信箱171，邮编80217-3364，丹佛，科罗拉多州

摘要

在发情前期（Pro/Est）和发情期（Est）或给卵巢切除后的雌性大鼠注射雌二醇后进行恐惧消退训练的实验中，与在黄体期（Met/Di）进行消退训练的雄性和雌性大鼠相比，这些雌性大鼠表现出更强的消退记忆能力和更低的恐惧复发率。在Pro/Est组中，这种效应依赖于黑质到背外侧纹状体（SN-DLS）多巴胺（DA）通路的活性。尽管升高的卵巢激素可以增强SN-DLS的DA活性，但目前尚不清楚发情期是否也会影响SN以外的其他儿茶酚胺能神经元的活性。此外，黑质-纹状体通路在恐惧消退过程中的具体作用机制尚未得到充分研究。为了解决这些问题，我们探讨了不同性别和发情阶段在恐惧消退过程中神经激活和功能连接性的差异，研究范围包括中脑儿茶酚胺能区域、传统的恐惧消退网络以及纹状体亚区。实验结果显示，Pro/Est组的雌性大鼠比雄性大鼠更少出现冻结行为；与前额皮质和扣带回相比，它们的cFos表达较低；而与雄性和Met/Di组相比，它们的内侧杏仁核cFos表达较高；同时，腹侧被盖区的DA神经元cFos表达也更高。此外，Pro/Est组的恐惧消退过程中的功能连接性最强，其中背外侧纹状体（DLS）被确定为网络中的关键节点，显示出对网络连接性的显著影响。这些发现为性别和发情阶段对恐惧消退过程的影响提供了新的见解，并表明DLS可能是Pro/Est组恐惧消退学习中的关键区域。

引言

学习到的恐惧抑制能力受损会导致与压力相关的疾病，如焦虑症和创伤后应激障碍。尽管女性比男性更容易患上这些疾病[1]，[2]，[3]，但在评估治疗效果时往往忽略了性别和卵巢激素状态[4]，[5]。暴露疗法是一种常见的治疗手段，它利用恐惧消退机制：将先前与创伤事件相关联的条件刺激（CS）在没有该事件的情况下反复呈现，从而形成新的记忆，使CS不再引发恐惧[6]，[7]。虽然重复暴露疗法可以产生持久的消退记忆，但其长期效果受到恐惧复发现象的影响，例如在不同于消退发生的情境中恐惧的再现[8]、重新暴露于创伤事件后恐惧的再次出现[9]以及时间流逝后恐惧的自发恢复[6]。因此，需要新的策略来促进抗复发的消退记忆，适用于男女两性。

在恐惧消退过程中，卵巢激素的存在可以调节消退记忆的提取和复发。在啮齿动物中，如果在发情前期（Pro/Est）或注射雌二醇（E2）后进行消退训练，可以增强消退记忆的提取并降低复发率，这比在黄体期（Met/Di）进行消退训练的雌性和雄性更明显[10]，[11]，[12]，[13]，[14]。同样，高雌激素水平也可以减轻患有PTSD的女性的恐惧[15]。虽然卵巢激素显然会影响消退学习的结果，但其具体机制仍不清楚。

恐惧消退的神经回路在啮齿动物中已被广泛研究[16]，[17]，[18]，[19]，并且这些发现也适用于人类[20]。这一经典回路涉及前额皮质（PFC）、杏仁核和海马体，其中多巴胺能（DA）信号来自腹侧被盖区（VTA），而去甲肾上腺素能（NE）信号来自蓝斑（LC）。在中前额皮质（mPFC）中，前额皮质（PL）在早期消退过程中通过刺激基底外侧杏仁核（BLA）向中央杏仁核（CeA）的投射来促进恐惧表达，而边缘下皮质（IL）则在后期消退过程中通过抑制BLA来抑制CeA的恐惧输出。同时，海马体编码情境信息以支持未来的消退记忆提取。VTA的DA神经元通过传递奖励和预测误差信号来促进消退学习[21]，[22]，[23]，而IL中的NE信号也有类似作用[24]。尽管对这些区域的多种操作都能影响消退记忆的提取，但它们对恐惧复发的作用往往未被评估，或者与对消退记忆提取的影响不一致[25]，[26]，[27]，[28]，[29]，[30]，[31]。这些不一致性表明消退记忆的提取和复发可能依赖于不同的机制，因此需要寻找新的治疗靶点，通过分析分布式网络动态可能更有效地揭示这些机制[32]，[33]，[34]，[35]。

最近发现，黑质（SN）到背外侧纹状体（DLS）的DA通路在支持抗复发恐惧消退中起着重要作用；这一通路的功能已超越了其在运动控制中的传统作用[36]，[37]，[38]，[39]，[40]，[41]，[42]，[43]。我们之前的研究表明，在消退过程中化学遗传学刺激SN中的DA神经元，或在消退前向其主要投射目标——背侧纹状体（DS）注入DA D1受体（D1R）激动剂，可以防止雄性啮齿动物的恐惧再现[44]。DS在解剖和功能上分为两个亚区：DLS和背内侧纹状体（DMS）。为了确定D1R信号在消退和恐惧再现中的作用是哪个亚区介导的，坦纳等人（2024年）在消退前将D1R激动剂注入DMS或DLS，结果发现仅增强DLS中的D1R信号就能防止恐惧再现[45]。基于这些发现，我们使用化学遗传学方法在消退过程中刺激SN-DLS通路，同样成功地防止了雄性大鼠的恐惧再现[13]。这些结果揭示了SN-DLS DA通路在支持抗复发恐惧消退学习中的新作用。

尽管在恐惧消退过程中刺激SN-DLS通路可以减少雄性的恐惧复发，但现有证据表明雄性在自然状态下并不活跃这一通路[44]，[45]，因此它们的消退记忆容易复发。相比之下，Pro/Est阶段的雌性可能会在消退过程中激活SN-DLS通路，从而减少恐惧复发。例如，在Pro/Est阶段，SN中的DA神经元cFos表达增加，DLS中的DA释放增强；而在消退过程中化学遗传学抑制SN-DLS通路则会导致Pro/Est阶段消退的雌性再次出现恐惧[13]。这些发现表明，雌性激活了特定的DA能通路（如SN-DLS通路），这些通路在抑制恐惧、支持消退学习方面具有性别和发情阶段依赖性。然而，目前尚不清楚DLS在恐惧消退过程中与其他脑区的功能交互机制，也不清楚SN以外的中脑儿茶酚胺能区域如何受到性别和发情阶段的影响。

本研究探讨了Pro/Est阶段的雌性在包括中脑儿茶酚胺能区域和背侧纹状体在内的分布式网络中，在恐惧消退过程中是否表现出独特的神经激活模式，以及DS与传统恐惧消退网络之间的功能连接模式。为此，我们在恐惧消退后测量了16个脑区的cFos表达，并计算了VTA和LC中表达酪氨酸羟化酶（TH）的神经元数量，利用皮尔逊相关系数评估了各区域之间的功能连接性。我们假设在恐惧消退过程中，Pro/Est阶段的雌性会表现出独特的神经激活和功能连接模式，并且与其他组相比，儿茶酚胺能区域的激活程度更高。

动物和饲养条件

实验使用了10只雄性和20只雌性Long-Evans大鼠（到达时年龄为P56天；来自马萨诸塞州威尔明顿的Charles River实验室），将它们配对饲养在通风良好的笼子中（尺寸为24L x 45.4W x 21H厘米），饲养环境温度控制在22°C，湿度受控，该饲养设施获得了实验室动物护理评估与认证协会的认可，位于科罗拉多大学丹佛分校Auraria校区。所有实验方案均得到了科罗拉多大学丹佛分校动物护理和使用委员会的批准。

Pro/Est阶段的雌性在恐惧消退过程中冻结行为较少

实验评估了性别和发情阶段对恐惧消退过程中冻结行为的影响（实验设计见图1A）。由于在Pro/Est阶段进行消退训练可以产生类似的抗复发效果，且在恐惧再现阶段的冻结行为在Met/Di阶段消退的雌性之间没有差异[13]，[14]，因此将雌性大鼠分为Met/Di组和Pro/Est组。这种分组可能反映了卵巢激素的持续影响。

讨论

本实验研究了性别和发情周期阶段对恐惧消退过程中神经激活和功能连接性的影响，以及儿茶酚胺能区域（包括VTA和LC）的参与情况。鉴于DS最近被发现在恐惧复发中起作用[13]，[44]，并且黑质-纹状体DA信号在Pro/Est阶段消退训练中的抗复发效果中起着关键作用[13]，因此本研究重点关注了DS的各个亚区。

资金来源

本研究得到了美国国立卫生研究院（National Institute of Health，项目编号068283）的支持。