GLB通过TLR4信号通路调节脑缺血损伤后小胶质细胞的M1/M2极化

《Behavioural Brain Research》：GLB regulates microglial M1/M2 polarization after cerebral ischemic injury via the TLR4 signaling pathway

GLB通过抑制Sur1-Trpm4通道及TLR4/NF-κB信号通路调节小胶质细胞M1/M2极化，减轻缺血性中风小鼠神经炎症和脑损伤。

　　

沈广宏|徐建波|陈建松|Irum Naz Abbasi|袁霞|吴飞|Javaria Sundus|杨倩宁|方马荣|Nashwa Amin

中国浙江省金华市金华市妇幼保健院临床实验室

摘要

缺血性中风（IS）后的炎症损伤严重限制了中风的治疗。小胶质细胞的极化参与了神经炎症反应的调节以及与IS相关的大脑损伤。己糖氯磺丙脲（GLB）已被证明可以抑制小胶质细胞的活化并减轻神经炎症。然而，GLB对小胶质细胞极化的作用及其机制在IS中的具体机制仍不清楚。在本研究中，我们探讨了GLB的神经保护作用及其可能的机制。我们检测了小鼠的梗死面积、血脑屏障（BBB）通透性和Zea longa评分，并使用旋转棒试验（Rota-Rod）和开放场地试验（OFT）评估了神经行为功能。通过Western blotting检测Sur1、Trpm4、TLR4、NF-κB、IL-1β和TGF-β的蛋白水平，同时使用免疫荧光（IF）检测Iba-1、iNOS和Arg-1。结果表明，GLB通过抑制Sur1-Trpm4通道减少了梗死面积，保持了BBB的完整性，并改善了神经功能。GLB上调了IS小鼠中的TGF-β和Arg-1表达，同时下调了TLR4、NF-κB、IL-1β、Iba-1和iNOS的表达，从而发挥了神经保护作用并减轻了神经炎症。总之，GLB可能通过调节小胶质细胞的M1/M2极化并抑制TLR4/NF-κB通路的活化来缓解IS。

引言

IS主要是由血栓导致的脑血流阻塞引起的[1]、[2]。尽管再灌注疗法已经取得了进展，IS仍然是全球主要的死亡和长期残疾原因[3]。越来越多的证据表明，小胶质细胞介导的神经炎症在IS的发生和发展过程中起着关键作用[4]。在IS的急性期和亚急性期，小胶质细胞会迅速活化并在损伤部位聚集。活化的微胶质细胞可以分为两种不同的功能表型：“经典活化”M1型微胶质细胞（也称为促炎表型）和“替代活化”M2型微胶质细胞（抗炎表型）[5]、[6]。值得注意的是，M1极化的微胶质细胞会释放促炎介质，包括白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），这些介质会驱动神经炎症并加剧神经元损伤[7]。相反，在IS的后期阶段，M2型微胶质细胞主要分泌抗炎细胞因子，如转化生长因子-β（TGF-β）和白细胞介素-10（IL-10），促进炎症消退、组织修复和细胞碎片的清除[8]。因此，深入了解如何调节M1型微胶质细胞和M2型微胶质细胞之间的极化至关重要。

在脑缺血的啮齿动物模型中，下调TLR4/NF-κB信号通路已被证明可以：（1）显著抑制M1极化微胶质细胞产生的IL-1β和TNF-α，从而减轻缺血后的神经炎症[9]；（2）强烈上调M2型微胶质细胞的活化，从而对缺血性脑损伤提供神经保护[10]。因此，我们假设TLR4/NF-κB信号通路是小胶质细胞极化的关键介质。先前的研究表明，抑制Sur1-Trpm4通道可以抑制NF-κB信号活性，进而减少神经炎症损伤[11]。此外，药理学抑制Sur1-Trpm4通道已被证明可以：（1）减弱微胶质细胞的活化，（2）减少促炎细胞因子的释放，（3）减轻脑水肿——这些都有助于神经保护[12]、[13]。然而，Sur1-Trpm4通道调节与IS发病过程中TLR4/NF-κB介导的小胶质细胞极化之间的精确机制关系仍需进一步阐明。

己糖氯磺丙脲（GLB）作为一种选择性的Sur1-Trpm4通道抑制剂，在临床前研究中显示出显著的神经保护作用，这归功于其抗炎和抗水肿特性[11]、[14]、[15]。临床证据进一步支持了其治疗潜力，显示GLB能够改善IS患者的神经功能恢复[16]、[17]、[18]。然而，GLB对脑缺血后小胶质细胞极化的影响机制尚未完全明确。本研究系统地探讨了GLB通过TLR4/NF-κB信号通路调节小胶质细胞M1/M2极化从而提供神经保护的新假设。我们的发现为GLB的治疗作用提供了机制上的见解，并增强了其作为IS病理学靶向治疗的潜力。

实验部分

动物

从杭州杭西生物技术有限公司购买了体重为20–30克的雄性C57BL/6小鼠。所有动物都被饲养在干净、无病原体的独立笼子里，提供充足的食物和水，室温为23±2°C，光照/黑暗周期为12小时。动物的护理和处理遵循浙江大学动物护理和使用指南。动物实验计划获得了伦理委员会的批准，批准编号：zju20240110。

实验组和药物给药

82只雄性C57BL/6小鼠被随机分为4组

GLB给药减少了神经缺陷

使用标准的行为测试评估神经功能，包括神经评分、OFT和Rota-Rod测试，这些测试是评估小鼠运动和神经缺陷的常用方法。神经评分升高、OFT中的运动距离减少以及Rota-Rod测试中的潜伏期延长反映了运动功能的受损。与对照组相比，中风诱导的小鼠表现出显著更高的神经缺陷评分（P<0.001，图1B），证实了这一点

讨论

本研究表明，己糖氯磺丙脲（GLB）通过调节小胶质细胞的极化发挥神经保护作用，这一作用涉及Sur1-Trpm4通道和TLR4/NF-κB信号通路两个机制。我们的发现表明，GLB治疗显著抑制了Sur1-Trpm4通道的表达，同时抑制了TLR4/NF-κB通路，导致小胶质细胞活化减少和M1表型标志物降低。重要的是，GLB促进了

结论

总之，在局灶性脑缺血的小鼠模型中，GLB通过抑制M1型微胶质细胞并促进M2型微胶质细胞的极化来发挥神经保护和抗炎作用，这是通过抑制Sur1-Trpm4通道活性以及调节TLR4/NF-κB信号通路实现的。因此，GLB有望成为未来临床治疗急性IS患者的潜在药物靶点。

局限性

本研究仍存在一些局限性。首先，我们没有进行关于最佳药物浓度的实验探索。其次，GLB是一种降糖药物，我们没有考虑其副作用。最后，本研究提出GLB通过抑制Sur1-Trmp4通道和TLR4/NF-κB通路来调节小胶质细胞的极化。然而，我们没有使用Sur1-Trpm4激动剂或TLR4激动剂来验证GLB对这些靶点的依赖性。未来，我们将重点研究

资助

本研究得到了浙江省重点研发计划（2023C03003）和金华市妇幼保健院（JHFB2023–1–03）的支持。

作者贡献声明

沈广宏：研究、数据分析。杨倩宁：撰写、审阅与编辑。方马荣：监督、项目管理、资金获取。Nashwa Amin：撰写、审阅与编辑、初稿撰写。Irum Naz Abbasi：数据验证。袁霞：数据验证。吴飞：数据管理。Javaria Sundus：方法学。徐建波：方法学、数据管理。陈建松：资源提供、项目管理。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突

致谢

我们感谢浙江大学神经科学研究所的技术支持。