综述：胶原三螺旋组装的分子基础：脯氨酰-4-羟化化的核心作用

《Biochemical Journal》：Molecular foundations of collagen triple helical assembly: the central role of prolyl-4-hydroxylation

本综述系统阐述了胶原蛋白三螺旋结构稳定性的分子基础，重点聚焦于脯氨酰-4-羟化化这一关键翻译后修饰的核心作用。文章结合胶原模拟肽实验与量子化学计算，深入解析了4-羟脯氨酸通过调控吡咯烷环构象、肽键构型及电荷转移相互作用，从而稳定胶原结构的分子机制，为理解胶原相关疾病的病理基础及生物材料设计提供了重要见解。

　　

胶原蛋白是细胞外基质的主要结构蛋白，对多细胞生命的演化至关重要。在其众多的翻译后修饰中，脯氨酰-4-羟化化是最为保守且功能关键的一种。这种羟化修饰不仅促进了单条胶原链形成聚脯氨酸II型螺旋结构，更支撑了三螺旋结构的稳定性和完整性。

Correlating melting temperature of collagen with conformational preference of pyrrolidine ring and peptide bond

胶原模型肽的研究在阐明4-羟脯氨酸对胶原热稳定性的影响方面发挥了关键作用。研究表明，胶原三螺旋的熔点温度与Y位脯氨酸衍生物的吡咯烷环构象和邻近肽键的构型偏好密切相关。

Preferential attainment of pyrrolidine ring at Yaa

在胶原重复的三肽模体（XYG）中，占据Y位的脯氨酸或其衍生物可以采取内向或外向两种吡咯烷环构象。研究发现，含有(4R)-氟代脯氨酸（(4R)-Flp-exo）、(4R)-羟脯氨酸（(4R)-Hyp-exo）和(4R)-甲氧基脯氨酸（(4R)-Mop-exo）的三螺旋，其熔点温度（T_m）依次为91°C、61°C和70°C，均显著高于仅含脯氨酸（Pro-endo， T_m≈ 41°C）的三螺旋。这揭示了在(4R)位引入吸电子基团，可通过 gauche 效应显著增强吡咯烷环采取外向构象的倾向，从而预组织胶原单链，使其更易于折叠成稳定的三螺旋结构。这种立体电子效应的强度与取代基的吸电子能力正相关。相比之下，在(4S)位引入体积较大的取代基（如(4S)-乙酰氨基脯氨酸）会产生空间位阻，即使其诱导产生外向构象，也会因空间排斥而导致三螺旋稳定性下降。这些发现凸显了自然界选择(4R)-羟脯氨酸作为胶原中最丰富的Y位修饰，是基于其最优的立体电子和空间效应组合。

Evaluating the relationship of the peptide bond proximal to the pyrrolidine ring at Yaa with thermal stability

肽键采取反式构型对于胶原单链形成PPII螺旋至关重要。实验测定的肽键异构化平衡常数（K_trans/cis）显示，倾向于外向构象的(4R)-Hyp-exo（K = 6.1）比倾向于内向构象的脯氨酸Pro-endo（K = 4.6）更偏好反式肽键。这种构象偏好与主链扭转角ψ密切相关，(4R)-Hyp-exo的ψ角约为151°，接近胶原三螺旋中的最优值（~150±9°），有利于肽链骨架形成预组织的PPII螺旋构象。反式肽键构型使得相邻羰基之间能够发生n→π电荷转移相互作用，该作用的强度可通过红外光谱中酰胺I带的伸缩频率和 Bürgi–Dunitz 轨迹（距离d ≈ 3.2 ?，角度θ ≈ 109°）来评估。例如，具有更强吸电子能力的(4R)-Flp-exo表现出更高的羰基伸缩频率（1748 cm^–1）和更接近理想的 Bürgi–Dunitz 轨迹，表明其n→π相互作用更强。将酰胺替换为硫酰胺后，硫代-(4R)-Flp-exo对反式构型的偏好（K = 9.9）和n→π*相互作用进一步增强。这些发现证实了Y位(4R)-羟脯氨酸通过促进吡咯烷环采取外向构象和肽键采取反式构型，协同增强了胶原单链的预组织程度和稳定性。

Computational exploration of the influence of conformations preferred by pyrrolidine ring and peptide bond on structural stability of collagen

计算研究，特别是密度泛函理论（DFT）计算，为理解立体电子效应在胶原稳定性中的作用提供了分子层面的深刻见解。

Investigating the influence of 4-C substituents on conformational preference for pyrrolidine ring pucker

计算表明，未修饰的脯氨酸本征偏好内向构象（ΔE_endo-exo≈ -0.4 kcal/mol）。而在(4R)位引入羟基后，(4R)-羟脯氨酸则转为偏好外向构象（ΔE_endo-exo≈ 0.6-1.1 kcal/mol）。吸电子能力更强的氟原子（(4R)-Flp）使这种偏好更为显著（ΔE_endo-exo≈ 0.8-0.9 kcal/mol）。这种构象偏好的转变源于σ→σ电荷转移相互作用：C^β–H_ax和C^δ–H_ax的σ成键轨道向C^γ–OH（或C^γ–F）的σ反键轨道转移电子，从而稳定了外向构象。计算得到的(4R)-Hyp-exo的E_σ→σ*约为8.8 kcal/mol，远高于其内向构象（3.3 kcal/mol）。

Understanding the conformational preference of peptide bond adjacent to pyrrolidine ring

计算一致预测，脯氨酸及其衍生物邻近的肽键均偏好反式构型（ΔE_cis-trans在0.1至2.5 kcal/mol之间）。Y位(4R)-羟脯氨酸的外向构象与反式肽键之间存在协同关系。

Evaluating the stabilizing charge–transfer interactions

n→π相互作用的强度（E_n→π*）与 Bürgi–Dunitz 轨迹的接近程度直接相关。在PO⁴G三肽模体的背景下，含天然构象(4R)-Hyp-exo的模体（PO⁴G-(R)-exo）表现出最强的n→π相互作用（E_n→π*≈ 0.9 kcal/mol），优于其非天然构象或脯氨酸模体（PPG）。与PPG相比，PO⁴G-(R)-exo的n→π相互作用增强了约0.3 kcal/mol，σ→σ相互作用增强了约4.0 kcal/mol。通过二维势能面扫描发现，吡咯烷环构象与肽键构型之间存在耦合：从反式/反式肽键构型（伴随外向环构象）向顺式/顺式构型（伴随内向环构象）转变过程中，n→π相互作用迅速减弱，而σ→σ相互作用也逐渐消失。这定量地揭示了不同立体电子效应之间的相互关联。

Understanding stability through the modeling of periodic structure of collagen

周期性DFT计算能够模拟完整的胶原三螺旋结构。研究表明，在单链状态，Y位脯氨酸或(4R)-羟脯氨酸倾向于采取内向构象更稳定。然而，在三螺旋状态下，Y位残基采取外向构象则能使三螺旋结构更稳定。计算结合能表明，含有PO⁴G模体的三螺旋比含有PPG模体的三螺旋稳定约3 kJ/mol，其中伦敦色散相互作用对结合能有重要贡献，而链间氢键作用相对较弱。

Conclusion and outlook

本综述整合了实验与计算研究，阐明了4-羟脯氨酸通过其独特的立体电子效应，精确调控吡咯烷环构象和肽键构型，进而稳定胶原三螺旋结构的分子机制。这些发现不仅深化了对胶原结构生物学基础的理解，也为研究与胶原构象异常相关的疾病（如成骨不全症、埃勒斯-当洛综合征）以及设计基于胶原的仿生材料提供了理论指导。未来研究可拓展至其他三肽模体（如XOG）以及脯氨酸的其他稀有修饰（如3-羟脯氨酸）对胶原稳定性的影响，并进一步在宏观分子水平探索立体电子效应在三螺旋组装中的作用。