多发性硬化症中神经病理性疼痛的EAE模型不需要百日咳毒素

《Brain Organoid and Systems Neuroscience Journal》：EAE models of neuropathic pain in multiple sclerosis do not require pertussis toxin

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中白喉毒素（PTX）的作用研究。比较PTX存在（EAE-PTX）和不存在（EAE-nPTX）的EAE模型，发现两者均出现运动功能障碍和机械/冷刺激痛觉过敏，但EAE-nPTX脱髓鞘更严重。ATF3在DRG中的普遍存在提示系统性炎症而非MOG刺激直接导致神经元损伤。

　　

Sydney R. Lamerand|Paramita Basu|Nina E. Gakii|Skyy S. Steber|Bradley K. Taylor

美国宾夕法尼亚州匹兹堡大学医学院麻醉学与围手术医学系、药理学系、匹兹堡疼痛研究中心以及匹兹堡遏制阿片类药物滥用项目

摘要

背景

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症（MS）的临床前模型，通常通过两次接种完全弗氏佐剂（CFA）乳化的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG_35-55）并添加百日咳毒素（PTX）来诱导。尽管PTX被认为必不可少，但最近的研究表明，即使没有PTX，EAE的病理变化也能发生。

目的

在包含PTX的传统EAE模型（EAE-PTX）和不含PTX的模型（EAE-nPTX）中，以及多个不含MOG_35-55的对照组（CFA-PTX和CFA-nPTX）中，评估了临床疾病和神经性疼痛的指标。

方法

使用一系列行为测试来评估雄性和雌性C57BL/6小鼠对机械、寒冷和热刺激的运动功能障碍和过敏反应，采用重复测量设计。在首次EAE接种一个月后，通过荧光髓鞘染色法评估脊髓、大脑皮层和周围神经的脱髓鞘情况，同时使用ATF3作为腰4-L5背根神经节（DRG）感觉神经元损伤的标志物。

结果

与CFA-PTX和CFA-nPTX对照组相比，EAE-PTX和EAE-nPTX组均出现了运动功能障碍、行为过敏反应以及脊髓腹侧的脱髓鞘现象，但大脑皮层未受影响。EAE-nPTX组的脊髓脱髓鞘程度比EAE-PTX组更严重。所有EAE和CFA对照组中均检测到ATF3，表明神经元损伤是由全身性炎症而非MOG_35-55驱动的神经病理变化引起的。

结论

在基于MOG_35-55的EAE模型中，PTX并非运动功能障碍和神经性疼痛发生的必要条件。新的EAE-nPTX模型具有模拟MS疾病的独特优势，同时避免了百日咳毒素的干扰效应。

引言

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统（CNS）的自身免疫性神经退行性疾病，表现为认知障碍（Benedict等人，2013年；Bisecco等人，2015年）、与皮质脊髓损伤相关的行走和步态异常（Morozumi等人，2024年）、与脊髓丘脑-皮质通路脱髓鞘相关的中枢性神经性疼痛（Rivel等人，2021年）以及与视神经脱髓鞘相关的视力障碍（Costello，2016年）。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型通常能再现MS的关键特征，包括神经炎症、脱髓鞘、神经退行性变、瘫痪和疼痛（Constantinescu等人，2011年；Iannitti等人，2014年；Yu等人，2020年）。EAE通常通过两次皮下注射完全弗氏佐剂（CFA）乳化的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽（MOG_35-55）并添加百日咳毒素（PTX）来诱导（Bjelobaba等人，2018年；Delarasse等人，2013年；Robinson等人，2014年）。MOG_35-55可激活外周淋巴组织中的自身反应性T细胞，使其在CFA诱导的免疫系统激活和血脑屏障（BBB）破坏的情况下穿过BBB（Fletcher等人，2010年；Furtado等人，2008年）。添加PTX被认为通过进一步破坏BBB的完整性来增强免疫细胞向CNS的浸润（Linthicum，1982年）。虽然EAE是一个有价值的模型，但它并不能完全再现MS的复杂性。例如，尽管大多数研究能观察到EAE中的脊髓脱髓鞘，但MS的病理特征还包括大脑皮层和小脑的脱髓鞘（Constantinescu等人，2011年；Gran等人，2008年；Sriram和Steiner，2005年）。事实上，脑部脱髓鞘是临床MS的关键特征，但在EAE模型中很少出现。然而，有研究表明，从EAE诱导方案中去除PTX可以导致大脑皮层的脱髓鞘（Blankenhorn等人，2000年；Murphy等人，2020年），这使一些人认为PTX可能抑制了脑部脱髓鞘。

1933年，首次在非人类灵长类动物中开发出类似EAE的模型，通过30-100次肌肉注射兔脑乳液来实现（Rivers等人，1933年）。1947年，该模型改进为包含含有灭活结核杆菌的脑乳液的弗氏佐剂，随后简化为单次注射方案（Kabat等人，1947年；Kabat等人，1951年）。20世纪50年代，使用热灭活的结核分枝杆菌在弗氏佐剂（即CFA）中开发了大鼠和豚鼠的EAE模型，以增强CNS对髓鞘蛋白的敏感性（Gold等人，2006年）。早期的小鼠EAE模型疾病发生率和进程不稳定（Gold等人，2006年），直到在MOG和CFA中加入PTX以提高BBB的通透性（Linthicum，1982年），并发现PTX的浓度依赖性可增加疾病和疼痛的严重程度（Bernard和Carnegie，1975年；Segal等人，2020年）。Wang等人（2017年）在C57BL/6小鼠中证实了PTX的必要性，他们报告称PTX对于运动功能障碍和脱髓鞘的表现是必需的。然而，这些研究并未尝试通过添加第二次加强注射来弥补PTX的缺失。当使用不含PTX的双次免疫方案时，有两项研究报道BC1（Blankenhorn等人，2000年）或C57BL/6小鼠（Murphy等人，2020年）出现了后肢瘫痪。然而，这些研究没有设置包含PTX和不含PTX的对照组进行直接比较。为了填补这一空白，我们进行了严格的、控制良好的对比研究。我们比较了实验室常规使用的基于PTX的EAE模型（EAE-PTX，Doolen等人，2018年；Iannitti等人，2014年；Rahn等人，2014年）与不含PTX的模型（EAE-nPTX，Murphy等人，2020年；Nguyen等人，2024年）的关键病理特征。

高达86%的MS患者会经历神经性疼痛。传统的EAE-PTX模型常用于研究与MS相关的过敏反应（Doolen等人，2018年；Lu等人，2012年；Olechowski等人，2009年）。为了确定PTX是否不仅对运动功能障碍，也对EAE相关的机械和寒冷刺激过敏反应必不可少，我们评估了EAE-PTX、EAE-nPTX和vEAE模型中对足底轻触或蒸发丙酮的反应（Doolen等人，2018年；Iannitti等人，2014年；Lu等人，2012年；Rahn等人，2014年）。我们和其他研究者发现，通过优化MOG_35-55、CFA和PTX的浓度，可以避免完全瘫痪。这使得我们能够持续数周或数月地评估足部撤回反射（Doolen等人，2018年；Olechowski等人，2009年；Rahn等人，2014年）。通过这种方法，我们以严谨的方式并在必要的对照组基础上确定了PTX是否对MS EAE模型中神经性疼痛的完全表现是必需的。

动物

野生型雄性和雌性C57BL/6小鼠从Jackson实验室（美国缅因州Bar Harbor）购买，年龄为9-11周。小鼠被饲养在温度（20-22°C）和湿度（45±10%）受控的环境中，光照/黑暗周期为12/12小时，食物和水可自由获取。所有动物实验均获得匹兹堡大学动物护理和使用委员会的批准，并遵循相关机构指南进行。

3.1. EAE-PTX和EAE-nPTX小鼠表现出相似的运动功能障碍和过敏反应

如图1所示，EAE-PTX小鼠、EAE-nPTX小鼠和vEAE小鼠均表现出运动功能障碍和过敏反应的行为迹象（先前已有报道：Doolen等人，2018年；Iannitti等人，2014年；Lu等人，2012年；Rahn等人，2014年；Murphy等人，2020年；Nguyen等人，2024年）。

有趣的是，EAE-nPTX小鼠的运动功能障碍发展得更快且程度更严重（见图1A-B）。虽然运动功能障碍持续存在……

PTX并非EAE中运动功能障碍或神经性疼痛表达的必要条件

MS相关的病变伴随脱髓鞘和中枢炎症以及疼痛调节途径的改变（Fernandez-de-Las-Penas等人，2015年；Rivel等人，2021年）。研究EAE模型病理和疼痛的基础科学研究人员通常在基于MOG_33–55的诱导方案中加入PTX，以促进免疫细胞进入CNS（Linthicum，1982年）。人们认为添加PTX可以促进后肢瘫痪和中枢脱髓鞘的完全表现

资助声明

本工作得到了F31NS125974（SRL）、T32NS073548（SRL）、T32NS007433（SRL）、R01NS112632（BKT）、R01DA37621（BKT）、R01NS45954（BKT）和Raymond和Elizabeth Bloch教育和慈善基金会的支持。

作者贡献

S.R.L.和B.K.T.设计了研究；S.R.L.、N.E.G.、S.S.S.、P.B.进行了研究；S.R.L.、S.S.S.、N.E.G.、P.B.和B.K.T.分析了数据；S.R.L.和B.K.T.撰写了论文。

伦理批准

所有动物实验均获得匹兹堡大学动物护理和使用委员会的批准，并遵循相关机构指南和规定，以及NIH关于实验室动物护理和使用的指南。

数据可用性声明

本研究的数据可应要求向通讯作者索取。

作者贡献声明

Sydney R. Lamerand：写作——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、项目管理、方法学、研究设计、资金获取、数据分析、概念化。Paramita Basu：数据分析。Nina E. Gakii：可视化、研究、数据管理。Skyy S. Steber：可视化、研究。Bradley K. Taylor：写作——审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、软件使用、资源管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。