《Brain Organoid and Systems Neuroscience Journal》：The mechanism of Calhm2 regulating the expression of CaMKIIα in spinal dorsal horn involved in the pathogenesis of bone cancer pain
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本研究针对骨癌痛（BCP）机制不清、缺乏有效治疗靶点的难题，探讨了钙稳态调节蛋白2（Calhm2）在BCP中的作用。研究人员发现BCP小鼠脊髓背角Calhm2和CaMKIIα表达显著上调，利用慢病毒敲低Calhm2可降低CaMKIIα表达、减轻机械性痛觉超敏并减少c-fos阳性神经元。结果表明Calhm2通过调控CaMKIIα促进脊髓背角神经元活化，从而参与BCP发生发展，为BCP治疗提供了新靶点。
对于晚期癌症患者而言，骨癌痛（Bone Cancer Pain, BCP）是一种极为常见且令人衰弱的痛苦，严重侵蚀着患者的生活质量。尽管临床上有一些镇痛方案，但往往效果有限，且长期使用非甾体抗炎药或阿片类药物会带来成瘾、胃肠道出血等严重副作用。因此，深入揭示BCP的发病机制，寻找新的治疗靶点，成为疼痛研究领域的迫切需求。
疼痛的产生与中枢神经系统的“敏化”密切相关，其中脊髓背角作为痛觉信息传递和整合的关键枢纽，其神经元的兴奋性改变是痛觉超敏（hyperalgesia）发生的重要基础。而神经元兴奋性的维持，又与细胞内外的钙离子（Ca2+）浓度动态平衡息息相关。钙稳态调节蛋白（Calcium homeostasis modulator, Calhm）家族是一类电压门控的非选择性离子通道，它们作为主要的ATP释放通道，在调节神经元兴奋性中扮演着关键角色。其中，Calhm2是研究较多的一个亚型，此前的研究多聚焦于其在抑郁症和阿尔茨海默病中的作用，近年来有证据表明它在前扣带皮层中也参与慢性炎症性疼痛。然而，Calhm2在BCP这一特殊的慢性疼痛状态中是否发挥作用，尚属未知。
另一方面，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II α, CaMKIIα）是中枢神经系统中含量最丰富的CaMKII亚型，广泛分布于脊髓背角浅层和背根神经节神经元中，已知其在疼痛相关的突触可塑性和中枢敏化过程中起着重要的调控作用。在BCP中，细胞内Ca2+浓度升高可激活CaMKIIα，但其上游的调控机制，特别是与Calhm2这一钙通道之间是否存在联系，仍有待阐明。
为了回答这些问题，发表在《Brain Organoid and Systems Neuroscience Journal》上的这项研究，深入探讨了Calhm2在BCP小鼠脊髓背角中的表达变化及其对CaMKIIα的调控作用，旨在为BCP的发病机制提供新的见解。
研究人员为开展此项研究，主要应用了几项关键技术。他们首先建立了小鼠BCP模型，通过向胫骨髓腔内注射LLC1小鼠肺癌细胞来模拟骨癌痛。为了特异性干预目标基因，研究团队构建了携带Calhm2特异性短发夹RNA（shRNA）的慢病毒载体，并通过显微注射技术将其精准递送至小鼠的脊髓背角区域。在行为学层面，他们使用电子von Frey仪定量评估小鼠的机械性痛觉超敏情况，即爪部回缩阈值（Paw Withdrawal Threshold, PWT）的变化。在分子机制探索方面，综合运用了实时定量逆转录聚合酶链式反应（Real-time RT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western Blot）和免疫荧光染色等技术，分别从mRNA和蛋白水平检测了Calhm2、CaMKIIα以及神经元活化标志物c-fos的表达与定位。
3.1. Calhm2在BCP小鼠脊髓背角表达上调，其敲低可缓解疼痛
研究人员成功建立了BCP小鼠模型，发现与假手术组（Sham）相比，BCP组小鼠在术后第7、14、21天均表现出显著的机械性痛觉超敏（爪部回缩阈值降低）。通过慢病毒介导的Calhm2基因敲低（BCP + Calhm2-LV组）有效逆转了这种痛觉超敏，其爪部回缩阈值显著高于注射对照病毒的BCP组（BCP + CON-LV）。分子水平检测显示，BCP小鼠脊髓背角中Calhm2的mRNA和蛋白表达量在术后三个时间点均显著上调，而Calhm2敲低则成功降低了其表达。这表明Calhm2参与了BCP的发生发展。
3.2. Calhm2与CaMKIIα在背角神经元中共定位
免疫荧光双标染色结果显示，在野生型小鼠的脊髓背角神经元中，Calhm2与CaMKIIα存在明显的共定位，这提示两者在细胞内可能存在功能上的相互作用，为后续研究其调控关系提供了形态学证据。
3.3. CaMKIIα在BCP中表达上调并被Calhm2敲低所下调
与Calhm2的变化趋势一致，BCP小鼠脊髓背角中CaMKIIα的mRNA和蛋白表达水平也显著升高。尤为重要的是，在敲低Calhm2后，CaMKIIα的表达也随之显著下降。这一结果强烈提示，在BCP状态下，Calhm2的上调可能正向调控了CaMKIIα的表达。
3.4. Calhm2敲低减少背角c-fos表达
c-fos是神经元激活的经典标志物。研究发现，BCP能诱导脊髓背角c-fos表达显著增加。免疫荧光双标证实Calhm2与c-fos在神经元中共表达。而敲低Calhm2后，c-fos阳性神经元数量明显减少。这说明Calhm2通过其调控作用，促进了BCP条件下脊髓背角神经元的激活。
综合以上研究结果，可以得出结论：在骨癌痛模型中，脊髓背角Calhm2的表达显著增加。Calhm2的上调可能通过促进钙离子内流等方式，进而导致其下游靶点CaMKIIα的表达升高。CaMKIIα作为一种关键的钙信号感应分子，其激活会进一步磷酸化NMDA受体等靶点，增强突触传递效能，最终导致脊髓背角神经元兴奋性增高（表现为c-fos表达增加）和中枢敏化，从而参与骨癌痛的发生和维持。慢病毒敲低Calhm2能够有效逆转这一过程，减轻疼痛行为。
这项研究的讨论部分进一步强调了其重要意义。研究首次揭示了Calhm2-CaMKIIα信号轴在骨癌痛中的关键作用，将一种重要的钙通道与痛觉中枢敏化的核心激酶联系起来，深化了对BCP分子机制的理解。Calhm2作为一个潜在的、可药物干预的膜通道蛋白，为开发针对BCP的新型镇痛药物提供了有前景的靶点。当然，研究也存在一些局限性，例如尚未验证CaMKIIα是否反作用于Calhm2，未使用钙成像或电生理技术直接记录神经元兴奋性的变化，以及实验仅使用了雄性小鼠而未考察可能的性别差异等，这些都为未来的研究指明了方向。尽管如此，该研究无疑为攻克骨癌痛这一临床难题提供了重要的理论依据和新的思路。
