综述：睡眠的系统生物学：走向分子与环路机制的综合理解

《Current Opinion in Biotechnology》：The systems biology of sleep: toward integrative understanding of molecular and circuit-based mechanisms of sleep

本综述系统梳理了睡眠研究领域的最新进展，重点介绍了结合高通量表型分析与前沿遗传操控技术（如无需交配的“新一代遗传学”和AAV介导的基因敲除）来系统鉴定睡眠调控分子（如Ca2+相关蛋白、蛋白激酶/磷酸酶）与神经环路的最新策略。文章提出了“睡眠的磷酸化假说”，阐释了分子信号如何形成调节神经元活动的“细胞睡意”，并探讨了将分子机制与环路基础相整合，最终实现睡眠调控的系统级理解乃至人工控制的未来前景。

　　

非侵入性睡眠记录与高可扩展性

为了系统鉴定睡眠的分子和环路调控因子，高通量、定量化的睡眠评估方法至关重要。脑电图（EEG）结合肌电图（EMG）虽是睡眠分期的金标准，但其有创性限制了大规模并行记录。为此，非侵入性睡眠记录方法得以发展，例如利用压电传感器监测身体运动、通过视频追踪界定持续不动（如超过40秒）作为睡眠的替代指标，以及基于呼吸模式进行全自动睡眠/觉醒分期。这些方法虽然不能完全替代EEG/EMG提供的神经生理信息，但其高可扩展性、低技术门槛和全自动化表型分析为大规模系统分析奠定了基础。

睡眠调控分子组分的鉴定

睡眠受遗传控制，这为通过系统性遗传筛选揭示其分子机制提供了依据。CRISPR/Cas9等基因组编辑技术的出现，特别是能够绕过繁育步骤、直接在F0代实现高效双等位基因敲除的“三重CRISPR”方法，极大地加速了反向遗传筛选的进程。利用这种“新一代哺乳动物遗传学”策略，研究人员系统性地敲除了特定基因家族（如Ca²⁺相关离子通道、泵和激酶，乙酰胆碱受体，蛋白激酶A（PKA）和蛋白磷酸酶PP1等）的成员，并评估其睡眠表型。研究发现，Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）α/β通路、毒蕈碱乙酰胆碱受体1和3（CHRM1/3）（其双敲除导致快速眼动睡眠（REMS）几乎完全消失）、具有促觉醒作用的PKA和具有促睡眠作用的PP1等分子在睡眠调控中扮演关键角色。为解决全身性敲除可能带来的发育效应或致死性问题，腺相关病毒（AAV）介导的出生后基因沉默（如利用AAV-PHP.eB通过眶后注射实现中枢神经系统（CNS）靶向递送）技术得到广泛应用，例如通过AAV递送CRISPR组件或Cre重组酶，实现了在特定细胞类型或脑区进行条件性基因敲除，进一步揭示了神经元蛋白磷酸酶（如钙调磷酸酶（calcineurin）、PP2A）在睡眠调节中的作用。

睡眠的磷酸化假说

遗传学研究的一个重要启示是，不仅离子通道、离子泵和神经递质受体，介导细胞内信号的蛋白激酶和磷酸酶也深度参与睡眠调控。除了上述的CaMKII、PKA、PP1等，正向遗传学筛选发现的Sleepy突变（盐诱导激酶3（SIK3）的功能获得性突变）以及细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）的敲除研究都支持了这一观点。尤为重要的是，调控核心睡眠磷酸酶（如PP1和钙调磷酸酶）的表达水平可以动态地大幅改变总睡眠时间。磷酸化蛋白质组学分析进一步表明，突触蛋白的磷酸化状态随睡眠-觉醒周期和睡眠需求积累而变化。基于这些发现，“睡眠的磷酸化假说”被提出，该假说认为觉醒引起的蛋白质磷酸化失衡是睡眠需求的整合器之一，从而促进睡眠。睡眠调控激酶/磷酸酶的活性可能随睡眠需求而变化，进而通过影响转录、突触可塑性或离子通道功能等下游效应器来改变神经元活动。

分子与环路睡眠机制的综合

磷酸化假说提示蛋白激酶/磷酸酶活性介导了单个神经元内的睡眠需求。另一方面，大脑中存在多个睡眠调控神经环路。分子信号是如何在这些睡眠调控神经元中实现整合的呢？研究关注于非快速眼动睡眠（NREMS）的细胞机制。许多皮层下神经元（如视前区、基底前脑等）被证明在激活时可促进NREMS。近年研究也揭示了大脑皮层（脑电活动的核心区域）在睡眠调控中的作用，例如沉默皮层第5层神经元的一个亚群会减少NREMS量和慢波活动（SWA）以及对睡眠剥夺（SD）的反应。通过c-Fos活性标记、全脑单细胞分辨率成像（如CUBIC技术）等方法，发现了对睡眠损失有反应并调控恢复睡眠的特定皮层神经元类型，如生长抑素（SST）表达中间神经元和皮层小清蛋白（PV）表达GABA能神经元。

一个关键问题是睡眠调控神经元如何感知睡眠需求的变化以改变其细胞活动。研究表明，细胞内信号（如Ca²⁺信号和相关蛋白磷酸化信号）可能是“细胞睡意”的来源。例如，在果蝇中，负责睡眠稳态的脑神经元内Ca²⁺水平在长时间觉醒期间升高；在小鼠中，CaMKIIβ的促睡眠磷酸模拟突变在兴奋性神经元中表达时能观察到促睡眠效应；在皮层PV神经元中，CaMKIIα可能通过其自身磷酸化感知睡眠需求的增加；丘脑 reunions (RE) 神经元中CaMKII的抑制会减弱对SD的稳态反应。此外，研究还发现，睡眠促进神经元中的细胞应激（如线粒体或胞质活性氧（ROS））也会诱导睡眠，例如中脑睡眠促进神经元中H₂O₂的觉醒依赖性积累通过TRPM2通道增强神经元活性。同时，觉醒系统（如蓝斑核（LC）去甲肾上腺素（NE）能神经元）的“疲劳”也可能导致“细胞睡意”。目前，除了少数先驱性研究，睡眠调控的分子和环路机制尚未完全整合。未来研究需要将高可扩展的区域/细胞靶向方法（如AAV工具）与睡眠分子调节因子的操控相结合，并整合单细胞/空间转录组分析，以揭示特定神经元内主导的睡眠调控信号和效应器。

未来展望

对睡眠分子和细胞水平基本调控原理的理解及其整合，为系统生物学中强调的对生物现象的控制和设计提供了线索。有证据表明，睡眠可能通过大脑皮层内的细胞自主机制进行调节。即使在清醒和行为动物中，新皮层的SWA也以使用依赖的方式局部发生。有趣的是，即使是二维的皮层神经元原代培养物也表现出类似于NREMS期间的神经元放电模式，这可能为睡眠调控的分子通路和神经环路的合成生物学方法提供了最小化的研究元素。麻醉为控制睡眠提供了另一种有趣的途径。虽然全身麻醉不同于自然睡眠，但与NREMS存在现象学联系。例如，七氟醚诱导的麻醉足以减轻SD后的NREMS增加，表明其调节睡眠稳态。乌拉坦能诱导NREMS样和REMS样状态的循环交替，提示其可能操纵或模拟睡眠调控机制。最近证据表明，全身麻醉和药理镇静的神经环路与自然睡眠共享。例如，异氟醚的直接分子靶点被确定为兰尼碱受体1（RyR1），这暗示了其与睡眠调控的Ca²⁺相关通路存在潜在联系。

结论

与几十年前睡眠仍是“黑箱”相比，近期发展的技术（如无需交配的基因敲除和AAV介导的出生后敲除）促进了睡眠调控分子原理的鉴定。这些分子见解正与环路机制相整合，特别是关于“细胞睡意”如何放大到调节动物睡眠/觉醒状态。对这些系统动态的理解使我们更接近于实现对睡眠的系统级理解，包括其控制和设计。实现睡眠系统生物学的挑战也将为理解其他机体水平的现象提供原理。