《Frontiers in Immunology》：NETs drive myocardial fibrosis in hypertension via an NF-κB/ferroptosis axis
引言
高血压心脏病（Hypertensive Heart Disease, HHD）是全球主要的健康负担，其特点是慢性压力超负荷导致心肌重构和纤维化。在高血压状态下，持续的动脉压力升高引发一系列适应性和适应不良的心肌反应，最终导致以左心室肥厚和微血管功能障碍为特征的心脏重构。其中，心肌纤维化——表现为细胞外基质和间质胶原的过度沉积——是标志性的病理特征，它导致舒张功能障碍并进展为射血分数保留的心力衰竭。尽管多种神经体液和机械因素与纤维化的发展有关，但近年研究强调了无菌炎症和受调控的细胞死亡途径在驱动纤维化过程中的关键作用。
铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的受调控细胞死亡形式，已在多种心血管环境中被证明是心脏损伤和纤维化重构的关键因素。越来越多的证据表明，铁死亡不仅导致心肌细胞丢失，还刺激损伤相关分子模式的释放，从而促进炎症反应和成纤维细胞活化。然而，铁死亡在高血压相关心肌纤维化中的具体作用，尤其是其起始触发因素和下游信号级联，仍是活跃的研究领域。
中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）是由活化的中性粒细胞释放的、由DNA、组蛋白和颗粒蛋白组成的网状结构，已被证实与先天免疫和组织损伤有关。除了其抗菌功能，NETs还被证明通过诱导内皮功能障碍、加剧氧化应激和促进成纤维细胞活化来促进心血管病理。在高血压模型中，NETs的形成与增加的心肌损伤和纤维化重构相关，但连接NETs与纤维化的分子介质仍未完全阐明。
核因子κB（Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB）是协调促炎和促纤维化基因表达的关键转录因子。心肌细胞中NF-κB的活化导致细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的上调，从而建立有利于纤维化的微环境。值得注意的是，NETs和铁死亡都被证明可以激活NF-κB信号通路，这表明存在一种机制上的汇聚，即中性粒细胞衍生产物和铁催化的脂质损伤可能通过NF-κB介导的转录重编程共同促进纤维化。尽管有这些进展，但NETs、NF-κB活化、铁死亡和高血压心肌纤维化之间的直接机制联系仍未探索。
本研究旨在验证以下假说：NETs通过激活NF-κB信号通路，进而促进心肌细胞铁死亡和成纤维细胞转分化，从而加剧自发性高血压大鼠的心肌纤维化。我们提供了新的证据，表明NETs降解或通路抑制可通过抑制NF-κB依赖性铁死亡反应来减轻纤维化，从而凸显了NETs/NF-κB/铁死亡轴作为HHD潜在治疗靶点的重要性。
材料与方法
细胞培养与处理
使用H9c2大鼠心肌母细胞系进行研究。细胞在补充有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37°C、5% CO2条件下常规培养。为模拟高血压应激并诱导促纤维化信号反应，细胞在达到70%融合度时，用10-6M的血管紧张素II处理24小时。
实验动物模型
研究使用了12只雄性SPF级大鼠，包括6只自发性高血压大鼠和6只作为对照的Wistar-Kyoto大鼠。SHRs被随机分为两组：对照组饲喂标准饮食，模型组饲喂高盐饮食以诱导高血压病理变化。所有动物实验均遵循遵义医科大学实验动物福利与伦理委员会的指南进行。
心脏超声评估
大鼠禁食12小时后，使用异氟烷麻醉，通过Vevo 2100高分辨率系统进行心脏超声成像。测量参数包括左心室舒张末期内径、收缩末期内径、室间隔厚度、左心室后壁厚度，并计算左心室射血分数和缩短分数。
关键试剂与抑制剂
研究中使用的主要试剂包括：血管紧张素II、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1、NF-κB抑制剂JSH-23、佛波酯、DNase I等。关键抗体针对GPX4、FTH1、ACSL4、α-SMA、胶原蛋白II、纤维连接蛋白、MMP3、磷酸化NF-κB p65、NF-κB p65、瓜氨酸化组蛋白H3、髓过氧化物酶等蛋白。
NETs的分离与鉴定
从大鼠外周血中分离中性粒细胞，使用PMA刺激诱导NETs形成。通过离心收集NETs，并通过免疫荧光染色检测瓜氨酸化组蛋白H3和髓过氧化物酶以确认NETs形成。
分子生物学分析
通过实时定量PCR和蛋白质印迹法分析基因和蛋白表达水平。使用商业试剂盒检测氧化应激标志物，如丙二醛、超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽。通过EdU染色评估细胞增殖。
统计学分析
所有实验均进行至少三次独立重复。数据以均值±标准差表示。组间比较根据数据分布情况使用Student t检验或非参数检验，多组比较使用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。
结果
自发性高血压大鼠的心血管功能障碍和心肌重构
与同龄的血压正常对照动物相比，自发性高血压大鼠表现出显著的生理改变。高血压动物的体重显著低于血压正常对照组。同时，高血压动物的收缩压显著升高。超声心动图评估显示高血压组心脏功能明显受损。高血压动物的左心室射血分数和左心室缩短分数均显著降低。
心肌组织的病理学检查显示高血压动物心脏结构严重紊乱。苏木精-伊红染色显示，对照组心肌细胞排列整齐，胞浆呈嗜酸性，中央有卵圆形细胞核，间质稀疏。相比之下，模型组心肌显示广泛的纤维化，特征为间质增宽，有大量均质粉红色胶原沉积。心肌细胞呈现碎片化和减少，残存细胞伴有核固缩。
Masson三色染色揭示了对照组和高血压动物之间心肌胶原沉积的显著差异。对照组大鼠心肌组织切片中，纤细的蓝色染色胶原纤维稀疏分布在间质中，连续的红色染色心肌占主导地位。胶原体积分数定量证实了这种最小程度的纤维化，平均约为3%。与之形成鲜明对比的是，高血压动物心肌切片表现出广泛的、特征性的严重纤维化。厚厚的蓝色染色胶原在血管周围形成显著的血管周围袖套。此外，弥漫性增殖的蓝色染色网状纤维遍布心肌间质。这种普遍的胶原沉积破坏了心肌结构，将心肌细胞隔离成岛状结构。定量评估证实了严重的组织病理学变化，显示高血压动物的CVF显著增加至约22%。
补充组织病理学证据，对关键心肌纤维化标志物的蛋白质印迹分析一致表明，高血压动物中的表达水平均高于对照组。这些分子发现证实了高血压心肌中纤维化通路在蛋白质水平上的激活。
转录组分析和实验验证揭示高血压心肌中NETs形成和纤维化标志物表达增强
转录组数据的主成分分析显示对照组和自发性高血压模型组之间存在明显分离，表明全球基因表达模式不同。热图分析显示，与对照组相比，高血压动物中有3,411个基因显著上调，3,718个基因显著下调。值得注意的是，在NETs相关基因中，高血压动物中有17个基因上调，51个基因下调。
免疫荧光染色显示，与对照组相比，高血压动物心肌组织中NETs标志物瓜氨酸化组蛋白H3和髓过氧化物酶的表达显著增加。一致地，大鼠血清的ELISA检测显示高血压动物中Cit-H3、MPO和中性粒细胞弹性蛋白酶水平均显著升高。心肌组织的蛋白质印迹分析证实了这些发现，显示高血压动物中Cit-H3和MPO蛋白表达高于对照组。
在细胞水平上，H9c2细胞的qPCR分析显示，与对照组相比，模型组和NETs处理组中纤维化标志物的mRNA表达均显著增加。蛋白质印迹进一步证实了这些结果，显示模型组和NETs组中α-SMA、纤维连接蛋白、胶原蛋白II和MMP3的蛋白水平均高于对照组。这些发现共同表明，高血压心肌的特征是NETs形成增加和纤维化标志物上调，无论是在体内还是体外。
高血压心肌中的铁死亡相关转录改变和NF-κB通路激活
积累的证据表明，高血压应激与心肌铁死亡和不良心脏重构相关。心血管铁死亡的综述一致将高血压心脏病列为观察到铁死亡损伤的病症之一，压力超负荷的实验模型显示心肌细胞铁死亡增加并进展为纤维化。血管紧张素II驱动的心脏肥大，一个经典的高血压模型，同样显示当铁死亡受到限制时具有心脏保护作用，支持了高血压刺激与心肌细胞铁死亡丢失之间的联系。并行地，炎症信号似乎与这一过程相交：NF-κB的激活被报道伴随并促进心脏环境中的铁死亡，并且临床前研究中该通路的抑制减轻了铁死亡相关的心脏损伤。
转录组分析清楚地区分了高血压模型组和对照组，并揭示了广泛的铁死亡相关重构。火山图突出了铁死亡相关转录本的显著变化，模型组心肌相对于对照组有94个基因上调，66个基因下调。
为了研究与NETs的潜在串扰，我们进行了整合NETs相关和铁死亡相关基因集的蛋白质-蛋白质相互作用分析。该分析表明两个模块之间存在相互连接。大鼠心肌中的蛋白质水平评估进一步支持了铁死亡的参与：蛋白质印迹显示，与对照组相比，高血压动物中ACSL4显著增加，FTH1和GPX4减少。
差异表达基因的通路富集证实了炎症信号的参与。KEGG分析显示NF-κB信号通路富集，而GO分析表明MyD88依赖性Toll样受体信号通路和更广泛的Toll样受体信号通路富集。与这些发现一致，整合铁死亡相关基因和NF-κB通路基因的PPI分析揭示了相互关联的网络。
最后，蛋白质印迹分析显示，模型组心肌中NF-κB通路的激活程度高于对照组。总之，这些数据描绘了高血压心脏组织中铁死亡特征与以NF-κB为中心的先天免疫信号传导相协调的转录组和蛋白质组改变。
NETs在H9c2细胞中促进铁死亡易感表型并激活NF-κB信号
为了确定NETs是否影响H9c2心肌母细胞的铁死亡相关变化和细胞增殖，我们首先通过EdU染色评估了DNA合成和关键氧化还原/铁指标。与对照组相比，Ang II处理组显示EdU掺入显著减少，分离的NETs同样抑制了增殖；用DNase I预处理NETs可使增殖活性恢复至接近对照水平。用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1或NF-κB抑制剂JSH-23进行药理学抑制，均能使NETs处理细胞的增殖显著恢复，并且JSH-23 + Fer-1联合处理比任一单药处理产生进一步的显著增加。
与对照组相比，Ang II处理组和NETs组的细胞内铁浓度显著升高，而DNase I预处理的NETs使铁水平恢复正常。Fer-1和JSH-23均显著降低了NETs诱导的铁积累，并且联合处理比任一单药产生更大的减少。氧化状态测量显示，与对照组相比，Ang II处理组和NETs组的MDA含量降低，SOD和GSH含量增加；DNase I处理的NETs使这些指标恢复至接近对照值。与单独NETs处理相比，用Fer-1或JSH-23处理增加了MDA并降低了SOD和GSH，联合方案比任一单药产生更大的变化。
与生化特征一致，蛋白质印迹分析显示，NETs暴露增加了促铁死亡酶ACSL4，并降低了铁储存蛋白FTH1和抗氧化酶GPX4，这些变化与在Ang II处理组和NETs处理组中观察到的变化相似，并被DNase I预处理的NETs逆转。Fer-1或JSH-23各自减弱了NETs诱导的ACSL4上调，并部分恢复了FTH1和GPX4水平；Fer-1 + JSH-23联合处理比单药处理产生进一步的恢复。
NETs还显著诱导了纤维化标志物的增加；这些升高被DNase I预处理所消除，并被Fer-1或JSH-23显著降低，联合处理观察到最强的抑制作用。最后，NETs显著激活了H9c2细胞中的NF-κB信号通路；DNase I预处理的NETs使NF-κB活化恢复至对照水平，Fer-1和JSH-23均抑制了NETs诱导的NF-κB活化，联合抑制产生最大的降低。总之，这些发现表明NETs在H9c2细胞中促进铁死亡易感的分子状态、氧化失衡和促纤维化蛋白表达，并且NETs降解或铁死亡和NF-κB信号抑制可减轻这些效应。
讨论
本研究提供了令人信服的证据，表明NETs通过协调铁死亡和激活NF-κB信号，在高血压动物心肌纤维化的发病机制中起着关键作用。通过体内和体外分析的结合，我们描绘了一个机制轴，其中NETs通过诱导氧化应激、铁死亡细胞死亡和促纤维化基因表达来促进心脏纤维化——这些过程可通过铁死亡或NF-κB的药理学抑制得到显著缓解。
在高血压动物中观察到的血压升高和左心室功能降低与自发性高血压大鼠相关的心血管表型一致。组织学检查证实了以胶原积累和成纤维细胞活化为特征的广泛心肌重构，并得到α-SMA、纤维连接蛋白、胶原蛋白II和MMP3等典型纤维化标志物上调的证实。这些发现与先前强调心肌纤维化在高血压心脏病中的核心作用的报告一致，并突出了自发性高血压模型在重现人类病理学方面的临床相关性。
本研究的一个关键发现是高血压动物中NETs形成增强，表现为心肌和血清中Cit-H3和MPO水平升高。NETs越来越被认为是超越其抗菌功能的致病实体，与动脉粥样硬化、自身免疫性疾病和心脏损伤有关。我们的转录组分析揭示了高血压心肌中NETs相关基因的差异表达，支持其在疾病进展中的积极作用。此外，将NETs应用于H9c2心肌母细胞，重现了体内观察到的纤维化表型，表明NETs不仅仅是组织损伤的副产品，而是纤维化重构的主动上游驱动因素。
在机制上，我们的研究表明NETs诱导心肌细胞铁死亡，其特征是细胞内铁水平增加、ACSL4上调以及铁死亡抑制蛋白FTH1和GPX4的同时下调。这种铁依赖性的受调控细胞死亡形式已成为导致心脏损伤的一种新方式，但其在NETs介导的纤维化中的作用在此研究之前尚未明确证实。重要的是，NETs的DNase I预消化消除了铁死亡反应，表明NETs相关的DNA结构是该通路中的必需效应物。这一发现强化了以下观点：细胞外染色质支架和组蛋白相关蛋白不是惰性副产物，而是能够重编程心肌细胞存活和氧化还原平衡的生物活性介质。
NF-κB信号轴作为连接NETs和铁死亡与纤维化的关键介质出现。差异表达基因的KEGG富集和心肌组织的蛋白质印迹证实了NF-κB在高血压动物中的激活。该通路在心血管疾病中协调炎症和纤维化转录程序的作用已得到充分证实。我们的数据显示，NF-κB的药理学抑制和铁死亡的抑制均能单独减弱H9c2细胞中NETs诱导的纤维化和铁死亡标志物。值得注意的是，它们的联合给药产生了协同效应，表明这些信号级联之间存在潜在的串扰。这种协同作用表明，铁死亡和NF-κB活化形成了一个自我强化的前馈循环，其中铁驱动的脂质过氧化放大NF-κB活性，而NF-κB活性又促进炎症基因表达，并进一步使心肌细胞对铁死亡敏感。
从转化角度来看，这些发现具有重要意义。首先，NETs可能作为高血压心肌重构的生物标志物和治疗靶点。循环中的Cit-H3和MPO可提供疾病活动的可及指标，而旨在NETs降解的干预措施可能减轻心脏纤维化。其次，铁死亡和NF-κB功能汇聚的证明为联合疗法提供了理论依据——例如，抗氧化剂、铁死亡抑制剂和抗炎剂——可以协同作用以抑制HHD中的纤维化进展。第三，我们的结果将高血压心脏病理学的概念框架从单纯的血液动力学超负荷扩展到包括免疫-细胞死亡串扰作为适应不良重构的基本驱动因素。
尽管如此，必须承认几个局限性。首先，虽然H9c2细胞系为心肌母细胞行为提供了稳健的模型，但它不能完全复制心肌微环境内的复杂相互作用，包括免疫细胞串扰和血液动力学应激。其次，尽管我们的数据支持NETs与铁死亡之间的因果关系，但未来采用遗传模型的研究将进一步证实这些关系。特别是，需要对NETs成分及其在心心肌细胞中的同源信号受体进行更精细的剖析，以建立明确的分子联系。最后，这些发现对人类高血压心脏病的转化相关性需要在临床标本或大型动物模型中进行验证。
总之，本研究阐明了NETs、NF-κB信号和铁死亡在高血压条件下心肌纤维化发病机制中的新机制联系。通过破坏这一致病轴，可能减轻纤维化重构，从而改善高血压心脏病患者的心脏结局。因此，我们的发现将NETs/NF-κB/铁死亡轴既作为一项机制见解，也作为一个具有转化相关性的治疗靶点，连接了基础发现和潜在的临床干预。
