《Frontiers in Immunology》：Panel of three cytokines predicts occurrence of aGVHD after allo-HSCT: a retrospective study
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本研究通过回顾性分析发现，白细胞介素-5（IL-5）、IL-8和IL-10组成的复合生物标志物面板，对异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后急性移植物抗宿主病（aGVHD）具有独立预测价值（HR=3.34），为aGVHD的早期诊断提供了新的血清学策略。
引言
异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治疗高危血液系统恶性肿瘤、其他危及生命的疾病和遗传性疾病的有效方法。然而，急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发生限制了allo-HSCT的广泛应用。aGVHD是allo-HSCT后常见的免疫并发症，也是移植后非复发死亡的最常见原因。它主要由活化的供体免疫细胞触发的针对受体细胞的免疫反应引起，通常发生在移植后100天内，主要影响皮肤、胃肠道和肝脏。
aGVHD的诊断主要依赖于靶器官的临床特征和病理活检，前者缺乏特异性，后者缺乏临床可行性。因此，许多研究致力于寻找与aGVHD相关的生物标志物。细胞因子是由免疫细胞分泌的小分子蛋白质，在免疫和炎症反应的调节中起关键作用。促炎和抗炎细胞因子可以特异性地指示aGVHD的发生和进展。诸如白细胞介素（IL）-6、IL-8和IL-2等细胞因子已被用作aGVHD的候选生物标志物，但不同研究结果存在争议。除了上述细胞因子，干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-10、IL-17A、IL-1β、IL-12P70、IL-4、IL-5和IFN-α也被认为是aGVHD病理过程中的核心元素。
本研究旨在检测接受allo-HSCT患者体内12种细胞因子（IFN-α, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12P70, IL-17A, TNF-α）的水平，并探讨这些细胞因子浓度与aGVHD发生之间的关联，以期建立一个能够预测aGVHD发生的细胞因子组合。
材料与方法
研究人群
这项回顾性研究纳入了2022年1月至2025年5月期间在上海长海医院接受allo-HSCT的155例患者。根据Mount Sinai急性GVHD国际联盟（MAGIC）标准诊断aGVHD。患者根据是否发生aGVHD分为对照组（非aGVHD组）和实验组（aGVHD组）。
预处理和GVHD预防方案
主要采用改良的白消安/环磷酰胺（BU/CY）清髓性预处理方案。该方案包括大剂量阿糖胞苷（3 g/m2/天，第-9至-8天）、白消安（3.2 mg/kg/天，第-7至-5天）、环磷酰胺（1.8 g/m2/天，第-4至-3天）和司莫司汀（250 mg/m2/天，第-3天）。此外，在第-4至-1天给予兔抗胸腺细胞球蛋白（2.5 mg/kg/天）。所有患者均接受钙调神经磷酸酶抑制剂（他克莫司或环孢素）、霉酚酸酯和短疗程甲氨蝶呤（第+1天15 mg/m2；第+3和+6天10 mg/m2）进行aGVHD预防。
样本采集与细胞因子测量
比较aGVHD患者诊断前最后一次采集的血样与无aGVHD患者在移植后相同时点采集的样本。实验组aGVHD发生的中位时间为移植后21.00天（四分位距[IQR]: 17.00 - 29.00）。该组样本采集于诊断前中位1.00天（IQR: 1.00 - 3.00）。对照组（无aGVHD患者）样本在移植后匹配的中位时间20.00天（IQR: 19.00 - 21.00）采集。使用双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒测量血样中的细胞因子水平，浓度以皮克/毫升（pg/mL）报告。
统计分析
使用R软件进行统计分析。正态分布的连续变量以均值±标准差表示，采用t检验比较；非正态连续变量以中位数（IQR）表示，采用Wilcoxon符号秩检验比较；分类变量以数字（百分比）表示，采用卡方检验或Fisher精确检验比较。通过受试者工作特征（ROC）曲线和曲线下面积（AUC）评估生物标志物的诊断价值并确定最佳截断值。根据截断值将患者分为高水平和低水平组。仅在ROC分析中显示显著判别能力的生物标志物进一步采用Kaplan-Meier生存曲线分析，并使用对数秩检验比较两组间aGVHD的累积发生率。采用单变量Cox回归分析筛选细胞因子，然后将显著变量纳入多变量Cox比例风险模型。使用确定的变量建立逻辑回归模型预测aGVHD。根据模型系数计算每个患者的复合风险评分（加权线性组合），作为代表aGVHD风险的连续变量用于后续分析。通过1000次重复的内部Bootstrap验证评估模型性能的稳定性。使用Benjamini–Hochberg错误发现率校正法调整P值。P < 0.05认为差异有统计学意义。
结果
人口学特征
研究纳入156例接受allo-HSCT的患者。aGVHD组64例（41.03%），男性占56.25%，中位年龄44.50岁（IQR: 32.00 - 55.50）。非aGVHD组92例（58.97%），男性占64.13%，中位年龄43.00岁（IQR: 31.00 - 53.00）。除移植物来源、供体来源和人类白细胞抗原（HLA）匹配比例外，两组患者的临床特征无显著差异。
aGVHD生物标志物的发现
共收集151例患者的样本，其中61例发生aGVHD。统计分析显示，在12种细胞因子中，有3种在两组间存在差异。aGVHD组患者的IL-5、IL-8和IL-10水平显著高于非aGVHD组。ROC曲线分析显示，IL-10对aGVHD的预测能力最佳（AUC: 0.662，95%置信区间[CI]: 0.566-0.752；敏感性70.49%，特异性62.22%；调整后P < 0.001），其次是IL-5（AUC: 0.652，95%CI: 0.562-0.750；敏感性63.93%，特异性65.56%；调整后P = 0.006）。Kaplan-Meier生存分析表明，高水平IL-10和IL-5的患者aGVHD累积发生率显著高于低水平组。
单变量Cox回归模型分析显示，除IFN-α、IL-2、IL-4、IL-12P70、IL-17A和TNF-α外，有6种细胞因子与aGVHD风险增加相关。多变量分析结果显示，IL-5（风险比[HR]: 2.21, 95% CI: 1.27-3.86; P = 0.005）、IL-8（HR: 1.90, 95% CI: 1.12-3.23; P = 0.017）和IL-10（HR: 1.86, 95% CI: 1.01-3.40; P = 0.045）是aGVHD的独立风险变量。
使用筛选出的三种生物标志物（IL-5, IL-8, IL-10）构建逻辑回归模型，形成复合生物标志物面板。复合风险评分公式为 Y = 0.0649 × IL-5 + 0.0052 × IL-8 + 0.0408 × IL-10 - 1.3839。ROC曲线分析显示，该面板预测aGVHD发生的AUC为0.722（95% CI: 0.629-0.806），敏感性75.41%，特异性63.33%（调整后P < 0.001），其性能优于任何单一生物标志物。
为评估复合生物标志物面板是否在临床风险因素之外提供独立的预测能力，进行了多变量Cox回归分析。模型纳入复合风险评分以及年龄、性别、性别匹配、身高、体重、诊断、HLA匹配比例、粒细胞植入时间、巨核细胞植入时间、造血恢复时间、供体来源、ABO血型不合、细菌/病毒/真菌感染等因素。分析结果显示，高风险的复合评分在调整这些临床变量后，仍与aGVHD发生率增加显著相关（HR = 3.34, 95% CI: 1.66-6.69, P < 0.001），而所有临床因素均未在模型中被识别为独立预测因子。这证实了复合生物标志物面板是aGVHD风险的一个强有力且独立的预测指标。
aGVHD生物标志物的验证
通过1000次重复的内部Bootstrap验证严格评估模型性能的稳定性。AUC值的直方分布近似正态分布，所有Bootstrap样本的AUC均值为0.715，95% CI为0.675-0.732。狭窄的置信区间反映了模型性能具有高度稳定性，与原始模型的AUC值0.722（95% CI: 0.629–0.806）一致。这表明基于IL-5、IL-8和IL-10的aGVHD风险预测模型具有良好的判别能力，可视为支持aGVHD风险临床评估的稳定可靠工具。
讨论
本回顾性研究探讨了12种细胞因子与aGVHD发生的关系，发现IL-5、IL-8和IL-10水平在发生与未发生aGVHD的患者间存在显著差异，且组合成复合面板后预测性能优于单一指标，并能提供超越临床因素的预测价值。内部验证证实该模型具有稳健的判别力和高稳定性。
尽管存在多种类型的生物标志物，但由于在aGVHD的基础和临床研究中细胞因子被广泛研究，细胞因子生物标志物尤其受到青睐。IL-5和IL-10主要由活化的辅助性T细胞2（Th2）分泌。在aGVHD患者中，Th2细胞被认为是抑制诱导aGVHD的辅助性T细胞1（Th1）反应的调节性T细胞。尽管分析IL-5水平与aGVHD关系的研究较少，但一些研究表明IL-5可能在aGVHD发病中起重要作用。IL-10是一种关键的抗炎细胞因子，通过负向调节多种促炎细胞因子的产生和功能来有效抑制过度炎症反应。IL-8是中性粒细胞趋化因子，通过招募和激活中性粒细胞在急性炎症反应中发挥作用。IL-8在ROC分析中仅显示边缘显著性，但在Cox回归分析中成为强有力的独立预测因子，这表明IL-8的预测价值主要在于其能提供超越IL-5和IL-10核心信号之外的补充信息。这些细胞因子在炎症通路中相互作用，在控制其他因素后，IL-8的独立贡献才完全显现。因此，IL-5、IL-8和IL-10的组合可能更全面地反映潜在的病理生理状态，并提供比任何单一生物标志物更好的诊断性能。
本研究开发的复合生物标志物面板在预测aGVHD发生方面表现出中等判别能力，其性能与一些已发表的aGVHD生物标志物模型相当，证实了使用外周血细胞因子进行风险预测的可行性。然而，其性能仍低于使用最先进的器官特异性生物标志物（如ST2和REG3α）所达到的优异预测准确性，后者直接反映胃肠道组织损伤。相比之下，复合生物标志物面板指示的是全身性炎症而非器官特异性损伤。但与专业组织损伤生物标志物不同，细胞因子IL-5、IL-8和IL-10在大多数临床实验室可以常规检测，这使得该面板可能更容易且更具成本效益地实施，特别是在资源有限的环境中。这表明该面板可以作为一种序贯诊断策略的实用组成部分，而非替代高特异性标志物。它可作为高灵敏度的初始筛查工具，识别更广泛的处于风险中的患者群体，然后对这些个体进行后续更明确的（尽管通常更昂贵的）生物标志物检测，从而优化资源分配。
本研究的局限性包括筛选的细胞因子数量有限、样本量小、回顾性设计无法准确分级aGVHD严重度和器官受累、缺乏外部验证等。未来需要纳入更全面临床分级的前瞻性研究，以及进行多中心验证以确认该复合生物标志物面板的诊断潜力。
结论
本研究证明，由IL-5、IL-8和IL-10组成的复合生物标志物面板可能作为预测aGVHD发生的重要生物标志物。然而，需要更大样本量的进一步研究来确认这些候选生物标志物在常规临床实践中的适用性。未来的研究应纳入更多细胞因子，以增强研究的全面性，促进对aGVHD严重程度的准确预测。
