《Frontiers in Aging Neuroscience》：The olfactory functional network in the Alzheimer’s disease continuum: a resting state fMRI study
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本文通过静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）技术，探讨了轻度认知障碍（MCI）患者嗅觉皮层（OC）功能连接模式在阿尔茨海默病（AD）连续谱中的变化。研究发现，相较于稳定型MCI（sMCI），转化为AD的MCI（cMCI）患者嗅觉皮层与后扣带回/楔前叶（PCC/PCU）功能连接增强，而与角回（AG）等区域的负连接减弱，且AG连接强度与嗅觉辨别得分呈负相关。这些结果提示，嗅觉网络与默认模式网络（DMN）的交互异常可作为MCI向AD转化的早期神经影像学标记。
1 引言
年龄相关的嗅觉功能障碍被定义为在衰老过程中出现的检测、识别或回忆气味能力下降。值得注意的是，嗅觉障碍被认为是阿尔茨海默病（AD）的早期常见症状，并且在轻度认知障碍（MCI）患者中也得到了充分记录。行为学研究表明，MCI患者的嗅觉障碍与更快的认知衰退和进展为痴呆的风险升高相关。
近期研究提示，嗅觉缺陷可能反映了AD相关的脑变化，包括影响嗅觉相关结构的脑萎缩和功能连接异常。在人类中，初级嗅觉皮层（POC）包括嗅球投射的皮层靶区——前嗅核、嗅结节、额叶和颞叶梨状皮层，以及杏仁核和内嗅皮层的亚区。在MCI和AD患者中，结构神经影像学研究显示嗅球、POC和海马的灰质体积减少；这种体积减少在MCI阶段即可检测到，并在痴呆阶段变得更加严重。此外，在主观认知下降（SCD）个体中也报告了内嗅皮层、梨状皮层、海马和杏仁核灰质体积的减少，以及内嗅皮层萎缩与嗅觉功能的相关性。事实上，从健康衰老到SCD和MCI的连续谱中，嗅觉相关脑区的萎缩似乎伴随着嗅觉功能的逐渐下降而进展。
在健康受试者中，基于任务的fMRI研究揭示了一个复杂的脑网络，即嗅觉网络（ON），参与气味识别、效价和强度处理。该网络包括POC和次级嗅觉区域，如海马、脑岛、纹状体、楔前叶和丘脑。在健康受试者中，ON与默认模式网络（DMN）具有强烈的功能相互作用，嗅觉刺激导致DMN的瞬时失活，可能反映了气味处理的认知和记忆需求。最近使用静息态fMRI的研究已经识别出跨POC亚区的不同连接模式，反映了嗅觉网络组织的复杂性。在MCI和AD痴呆中，结构异常通常伴随着嗅觉相关区域的功能变化，与健康对照组相比，AD患者在嗅觉刺激期间报告了POC、海马和脑岛的激活减弱。这些区域的激活与嗅觉和认知功能显著相关。MCI和AD患者中也描述了ON的任务相关参与减少和DMN活动抑制减少，突出了AD连续谱中嗅觉和静息态网络的选择性脆弱性。
先前的研究旨在识别从MCI转化为AD痴呆的神经影像预测因子，证明了改变的静息态连接具有复杂多变的模式——尤其是在DMN内。MCI向AD转化的影像预测因子已在内侧颞叶中被识别，最近结合机器学习方法的神经影像学研究证明了使用fMRI特征具有可靠的预测价值。最后，来自近期一项荟萃分析的证据并未发现嗅觉功能与淀粉样蛋白-β（Aβ）/tau负荷之间存在强关联，突出了AD中嗅觉功能障碍的复杂性，并表明嗅觉表现本身可能不足以解释功能连接变化。
综上所述，这些发现表明，嗅觉相关区域的结构和功能改变在AD连续谱的早期出现，并可能有助于观察到的嗅觉表现变异性。然而，尽管证据不断增加，静息态连接测量本身目前并不能作为进展为痴呆的有用生物标志物。最近的证据表明，将静息态连接测量与嗅觉测试相结合，可能为识别临床进展的早期指标提供更有前景的方法。基于此原理，本研究旨在调查嗅觉皮层（OC）的静息态功能连接——被视为ON完整性的代理——是否有助于在基线时区分在4（±1.6）年随访期间保持临床稳定（sMCI）或转化为AD痴呆（cMCI）的MCI患者。鉴于rs-fMRI比基于任务的范式更容易实施——特别是在理解指令可能受患者认知状态影响的神经退行性疾病中——我们关注OC作为种子区域，以探索其在疾病进展早期的功能连接。最后，我们评估了嗅觉表现与OC功能连接之间的关系，以确定特定的连接模式是否可能反映与转化风险相关的早期嗅觉相关神经脆弱性。
2 材料与方法
2.1 参与者与研究时间线
30名遗忘型MCI患者（16名男性；平均年龄±标准差，70.4 ± 8岁）从意大利摩德纳大学医院的认知神经科诊所招募。患者在MCI诊断时（T0）和至少2年后的随访时（T1）接受神经学检查和神经心理学评估。认知障碍程度通过简易精神状态检查（MMSE）评估。在T0，患者还接受了嗅觉功能评估和多模态MRI协议。MCI诊断根据更新的Petersen标准确定。参与者需要满足以下所有条件：（i）由参与者和/或知情者报告的主观认知关注；（ii）客观认知障碍，定义为在记忆认知领域表现低于年龄和教育调整后常模≥1.0–1.5个标准差；（iii）保留的功能独立性，操作化为完好的基本日常生活活动且工具性日常生活活动（IADL）无临床显著损害（IADL评分在正常范围内）；（iv）无痴呆，基于临床访谈和全局认知筛查（MMSE和/或MoCA）不符合痴呆水平损害。AD诊断遵循NIA–AA标准。纳入AD组的所有患者均符合很可能AD痴呆的标准。先前、当前或过去有其他神经系统疾病、神经外科手术或主要精神疾病史被视为排除标准。参与者接受了急慢性鼻部疾病（如鼻炎、鼻窦炎）和暂时性上呼吸道感染的筛查；基线时存在任何此类情况的个体和吸烟者被排除，以确保嗅觉表现不受外周因素影响。人口统计学和认知特征见表1。研究根据2013年版《赫尔辛基宣言》进行，并已获得艾米利亚北广域伦理委员会批准（协议号：107/2016/SPER/AOUMO），所有受试者在参与研究前均提供了书面知情同意。
2.2 嗅觉评估
在T0使用Sniffin’ Sticks评估患者的嗅觉功能，通过三个子测试：阈值、识别和辨别。在阈值测试期间，向患者呈现16组笔。根据标准化Sniffin’ Sticks协议，在阈值评估期间参与者被蒙住眼睛以防止视觉线索影响气味检测。其中一支笔含有按递减浓度稀释在溶剂中的正丁醇或苯乙醇（BUT/PEA），另外两支笔仅含溶剂。参与者必须从三支笔中识别出含有BUT/PEA的笔。识别测试包括16种气味。暴露于气味3–4秒后，参与者被要求确定四张物品卡中哪一张最能描述该气味。16个中正确回答的数量代表识别得分。在辨别测试中，要求参与者在16组气味中识别出哪一支笔的气味与其他两支不同。气味辨别得分是16个中正确回答的数量。检查员在使用无味手套的同时用毡尖笔呈现每种气味。
2.3 随访与诊断分类
在随访时，患者被分类为sMCI（保持临床稳定）或cMCI（转化为AD）。AD的临床诊断根据已发表的标准由擅长神经退行性和认知障碍的神经科医生（MT和AC）做出。使用日常生活活动（ADL）和工具性日常生活活动（IADL）量表评估功能状态，以进一步描述参与者的日常功能。
2.4 行为学分析
使用Shapiro–Wilk检验评估数据分布。根据其分布特征，使用T检验或卡方（χ2）检验比较sMCI和cMCI患者的人口统计学数据、MMSE得分和Sniffin’ Sticks子测试得分以及总分（TDI）。根据Bonferroni校正（n = 4, α = 0.05），Sniffin’ Sticks子测试得分的组间比较若p < 0.0125则认为具有统计学显著性。根据已发表的正常值计算患有嗅觉减退、嗅觉正常和嗅觉缺失的转化和稳定患者的百分比。使用JASP软件版本0.18.3分析数据。
2.5 fMRI协议
使用3T Philips Achieva MR扫描仪获取MRI记录。静息态功能数据包括梯度回波平面序列，采集30个轴向连续层（TR = 2,000 ms, TE = 35 ms, 平面内矩阵 = 80 × 80, 体素大小: 3 × 3 × 4 mm, FOV = 240 mm, 总持续时间 = 8 min, 240个体积）。层间采用隔行升序采集。使用泡沫垫以提高受试者在线圈内的舒适度并尽量减少可能的头部运动。所有受试者被指示保持清醒，不要将思想集中在任何特定事物上，避免任何结构化的心理活动（如计数、复述等），并保持眼睛闭合。采集了几个初始的伪扫描，但它们被扫描仪自动丢弃且不存储。还为每个参与者获取了高分辨率T1加权解剖图像，以允许空间标准化和解剖定位。该体积由170个矢状层组成（TR = 9.9 ms, TE = 4.6 ms, 平面内矩阵 = 256 × 256, 体素大小 = 1 mm各向同性）。
2.6 fMRI数据处理与分析
使用MATLAB R2020a和SPM12对MRI数据进行预处理和分析。每个参与者的功能体积进行了层时间校正，并重新对齐到采集的第一个功能体积。T1加权图像配准到平均功能图像，并使用SPM的标准组织概率图进行分割。估计的形变场扭曲参数（标准SPM分割）用于归一化到SPM12中实现的蒙特利尔神经学研究所（MNI）模板。在 nuisance 回归之前，对体素-wise BOLD时间序列应用时间滤波器（0.01–0.08 Hz），以减少低频漂移和高频生理噪声。最后，使用FWHM = 6 × 6 × 8 mm3的高斯核对功能体积进行平滑。
2.6.1 基于种子的功能连接分析：嗅觉皮层
使用体素-wise方法通过计算两个感兴趣区域（ROI）与大脑内每个体素之间的功能连接模式来获得功能连接图。使用AAL2图谱定义两个种子区域，分别对应左、右嗅觉皮层（OC），包括梨状皮层和相邻的嗅觉区域。对于每个参与者，使用MarsBaR从每个种子区域提取T0时的平均BOLD信号时间进程。
对每个参与者进行了两个独立的一级回归分析，一个针对左OC，一个针对右OC。执行单个体素-wise一般线性模型（GLM），将种子区域的时间进程作为感兴趣回归因子输入。六个刚性头部运动参数（平移和旋转）以及来自白质和脑脊液的平均信号时间进程作为 nuisance 回归因子包含在内。未应用全局信号回归（GSR），也未执行运动异常体积的清理或排除。通过估计左、右OC时间序列与全脑之间的回归系数生成单个患者对比图像。
然后将每个患者的对比图像输入二级全因子设计（2 × 2），以组（cMCI和sMCI）和种子偏侧性（左、右嗅觉皮层）作为因子。年龄和性别作为不感兴趣的协变量包含在内，以解释个体变异性。使用体素-wise p < 0.001和簇范围阈值法对统计图进行阈值化，以实现全脑家族 wise校正α < 0.05。
使用cMCI与sMCI的对比从产生的功能簇中提取beta值。Beta估计值代表种子区域与每个体素之间BOLD信号协变的强度，被绘制出来进行详细检查，并用作与Sniffin’ Sticks子测试得分进行相关分析的功能连接度量。对所有相关性应用Bonferroni校正（n = 3, α = 0.05），若p值p < 0.0167则认为具有统计学显著性。
3 结果
3.1 行为学数据
基于既定正常值，3名cMCI患者（21%）和1名sMCI患者（7%）符合功能性嗅觉缺失的标准（总分 ≤ 16.5）。1名cMCI患者（7%）和3名sMCI患者（20%）处于嗅觉正常范围（总分 > 30.5）。大多数参与者——10名cMCI患者（71%）和11名sMCI患者（73%）表现出嗅觉减退（得分在16.5和30.5之间）。cMCI组的辨别得分（7.6 ± 2.0）倾向于低于sMCI组（9.4 ± 2.6），尽管这种差异未达到统计学显著性[t(27) = 2.094, p = 0.046]。阈值、识别和总分在组间具有可比性（详见表1）。
3.2 fMRI数据
3.2.1 cMCI和sMCI中嗅觉皮层的功能连接
基于种子的分析显示，两组的OC均与双侧前脑岛、前扣带皮层、额中回、海马、杏仁核、海马旁回、中央前回以及左偏侧化的顶上小叶、角回（AG）和缘上回（SMG）簇存在功能连接。sMCI组的OC显示出与后扣带皮层（PCC）、双侧额下回（眶部）、额上回、楔前叶（PCU）、辅助运动区（SMA）以及壳核和尾状核的额外功能连接。
与sMCI相比，cMCI显示出嗅觉皮层与PCC/PCU的功能连接增强，以及与左SMG/AG的负功能连接减弱。还观察到cMCI中OC与后部中扣带皮层（MCC）、SMA和左中央前回、中央后回的功能连接减少。
3.2.2 相关分析
左SMG/AG的Beta值与辨别得分呈负相关，与组别无关（r = ?0.59; p < 0.001）。未发现从PCC、SMA、MCC、中央后回提取的beta值与阈值、辨别和识别得分之间存在显著相关性。
4 讨论
本研究旨在调查嗅觉皮层的功能连接在MCI诊断时是否已经发生改变，以及它是否能预测未来向AD痴呆的转化。我们发现，在转化为痴呆的MCI患者（与稳定型MCI相比）中，OC与内侧区域（后部MCC、SMA）和左感觉运动区域的功能连接减少。同时，它与PCC/PCU的连接增强，与左下顶叶（SMG/AG）的负连接减弱。OC与SMG/AG之间增强的功能连接也与辨别表现呈负相关。
嗅觉功能障碍会增加痴呆风险，特别是与AD遗传易感性相结合时，但这种机制的神经基础仍不清楚。OC是嗅觉网络的关键区域，是MCI和AD痴呆中更容易发生结构和功能改变的嗅觉相关区域之一。我们发现OC与MCC、SMA和感觉运动区域的功能连接减少。MCC的后部在身体对感觉刺激的空间反射性定向中起主要作用，这一功能关键受顶叶传入投射的调节。它与感觉运动网络功能连接。有研究报告MCI患者与健康受试者相比，MCC与运动和运动前区域的功能连接模式存在显著差异。在本研究中，MCC、SMA和中央后回区域与OC的功能连接较低提示这些区域参与了转化为AD痴呆的MCI患者的嗅觉功能障碍。我们推测这可能源于这些区域在朝向感觉（包括嗅觉）刺激的定向中的作用。
出现了与PCC/PCU（后部DMN的关键组成部分）的OC功能连接增强，DMN是在AD连续谱中已知易受影响的网络。先前的证据表明嗅觉处理与DMN枢纽之间存在功能耦合，如在AD痴呆患者与健康对照组相比，嗅觉fMRI期间DMN的任务相关功能抑制减少所证明的。PCU在嗅觉中的重要性进一步得到一项涉及无痴呆个体（有和无嗅觉识别缺陷）的研究的强调，该研究揭示了经历嗅觉障碍的受试者中PCU的功能连接变化。因此，在cMCI中观察到的增强的OC–PCC耦合可能反映了整合嗅觉、注意力和记忆过程的大规模网络的早期破坏。
我们的数据还揭示OC与SMG和AG的功能连接增强，同时这些区域与患者的气味辨别表现呈负相关。AG作为跨模态枢纽，多感觉信息在此结合和整合。我们的数据与先前的研究一致，该研究显示与健康对照组相比，获得性嗅觉缺失个体的OC到AG的动态功能连接显著更强，并且这些功能连接值与Sniffin’ Sticks的总分呈显著负相关。我们研究的结果支持Iravani等人（2021）的假设，即OC与AG以及PCC之间的功能连接变化充当了一种感觉代偿机制。我们在本研究中识别的AG功能连接与嗅觉辨别表现之间的负相关进一步支持了这一假设，强化了Iravani等人（2021）的发现。
尽管sMCI和cMCI参与者在基线时表现出可比的嗅觉表现，但嗅觉皮层功能连接的组间差异可能指示在疾病过程中非常早期出现的改变，可能先于明显或临床显著的嗅觉缺陷。汇聚的证据表明，嗅觉系统在AD的前驱阶段受到影响，嗅觉区域的早期神经病理学和网络水平变化预示着明显的嗅觉下降和痴呆发作。在此框架下，cMCI个体中 disrupted 的嗅觉相关FC可能反映了前驱期的回路脆弱性，而传统的心理物理测试仅能部分捕捉到这一点。此外，这些结果强调了FC改变作为高度敏感的神经影像指标，用于在阿尔茨海默病前驱阶段检测高风险个体的效用。
5 局限性与未来方向
我们的工作有以下局限性。首先，相对较小的样本量和部分参与者较短的随访时间可能降低了我们分析的统计效力。增加样本量和随访持续时间将允许更稳健地研究嗅觉表现与rs-fMRI测量之间的关系，并增强研究结果的临床意义。更大、更平衡的队列也将能够更清晰地比较有嗅觉障碍并转化为AD痴呆的MCI个体与保持稳定的嗅觉正常个体。此外，将分析扩展到嗅觉皮层区域之外可能提供对MCI和AD中早期嗅觉相关网络改变的更全面理解。另外，一些临床和人口统计学变量——如抑郁症状、合并症（如高血压、糖尿病、血管疾病）——未被系统收集，限制了对样本的表征。未来的研究应包括这些测量，以更好地解释嗅觉功能的潜在调节因素及其与神经退行过程的相互作用。
6 结论
总之，我们的结果支持静息态数据与嗅觉测试相结合作为检测从MCI向AD痴呆转化的早期和临床前体征的有前景的指标。我们的结果（i）与先前显示MCI和AD痴呆患者嗅觉相关区域功能变化的研究一致，以及（ii）支持嗅觉网络与DMN之间的强烈相互作用，以及ON和DMN在AD连续谱中的早期选择性脆弱性。此外，我们的结果凸显了AG的关键作用，我们推测嗅觉能力与这个多感觉整合区域的功能连接之间的负相关在MCI诊断时可能作为进展为AD痴呆的标志物。
