《Journal of Advanced Research》：Study on the formation mechanism of the key fresh aroma component (
Z)-3-hexen-1-ol during the spreading process of lu’an Guapian green tea
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本研究聚焦绿茶摊放过程中香气品质调控的关键科学问题。针对六安瓜片绿茶，研究人员通过多组学联用技术，揭示了摊放脱水应激通过激活转录因子CsERF105，进而调控关键基因CsADH1表达，促进清香组分(Z)-3-己烯醇生物合成的分子机制。该研究首次解析了茶叶加工条件与香气形成的内在关联，为精准调控茶叶香气品质提供了新靶点。
当您冲泡一杯上好的六安瓜片绿茶时，那清新怡人的"清香"是如何形成的？这背后隐藏着茶叶加工过程中的奥秘。绿茶作为全球产量最高、消费最广的茶类，其品质特征主要取决于色、香、味三个方面，其中香气是决定绿茶品质的关键因素，直接影响市场接受度和经济价值。然而，茶叶采后加工过程中香气品质的调控机制仍是一个关键但尚未深入探索的领域。
在绿茶加工过程中，摊放是一个诱导脱水应激的关键步骤，显著影响香气形成，但其潜在的分子机制至今仍不清楚。随着摊放过程中鲜叶水分含量的逐渐降低，其物理性质和化学成分发生显著变化，这为成品茶品质形成奠定了物质基础。虽然已有研究表明，摊放/萎凋过程中脱水应激会上调LOX和TPS基因的表达，促进特征性香气成分如(Z)-3-己烯醇、芳樟醇和α-法尼烯的形成，但对于许多关键香气化合物的生物合成途径及其调控机制仍存在显著的知识空白。
针对这一科学问题，研究人员以中国名优绿茶六安瓜片为研究对象，系统解析了摊放工艺对茶叶清香品质形成的影响机制。研究发现，当鲜叶摊放至水分含量68%-71%时，最有利于六安瓜片清香特征的形成。通过感官组学分析，(Z)-3-己烯醇被确定为清香品质的关键贡献成分，其在摊放过程中呈现明显的积累趋势。
为了深入解析(Z)-3-己烯醇的生物合成机制，研究团队采用了整合多组学方法，包括气相色谱-质谱联用(GC-MS)、气相色谱-嗅闻-质谱联用(GC-O-MS)和气味活性值(OAV)分析来剖析香气化合物谱，同时利用转录组学识别相关的基因表达变化。关键发现通过亚细胞定位、体外酶活性测定、茶树瞬时过表达、启动子克隆、酵母单杂交(Y1H) assay、荧光素酶(LUC)报告基因 assay、电泳迁移率变动 assay(EMSA)以及外源乙烯利处理等多种生物学技术进行了验证。
研究结果部分，首先通过香气评价发现，随着鲜叶摊放程度的增加，清香香气的强度和持久性先升高后降低，在水分含量68%-71%范围内保持较高水平，但当水分含量低于65%时显著下降。这表明适当的鲜叶摊放程度可以增强六安瓜片绿茶的清香特征，从而提高其整体香气品质。
在关键清香成分筛选中，通过GC-MS、OAV和GC-O-MS分析，从61种鉴定出的化合物中筛选出21种关键香气贡献化合物，其中(Z)-3-己烯醇、芳樟醇、壬醛、香叶醇、β-月桂烯和(E)-β-罗勒烯被确定为六安瓜片特征清香品质形成的重要成分。值得注意的是，(Z)-3-己烯醇不仅与其他香气化合物共同影响茶的清香品质，其本身也是清香属性的特征性组分。
对(Z)-3-己烯醇生物合成途径的分析显示，在摊放过程中，有11个差异表达基因直接参与其生物合成，其中6个DEGs的表达水平呈现显著上升趋势，包括4个LOXs、1个HPL和1个ADH。相关性分析表明，(Z)-3-己烯醇含量的变化与CSS0023501和CSS0021634的表达水平呈显著正相关，其中CSS0021634（命名为CsADH1）与(Z)-3-己烯醇含量的相关性最强，且在摊放过程中表达量持续上升。
CsADH1的功能分析表明，该基因CDS区长1143 bp，定位在茶树第9号染色体上，编码一个由380个氨基酸组成的蛋白质。亚细胞定位实验证实CsADH1蛋白主要定位于细胞核和细胞质，体外酶活性测定显示CsADH1能够特异性催化(Z)-3-己烯醛转化为(Z)-3-己烯醇。茶树瞬时过表达实验进一步验证了CsADH1在(Z)-3-己烯醇生物合成中的关键作用。
在上游转录调控因子挖掘中，通过酵母单杂交库筛选鉴定出7个可能与CsADH1启动子相互作用的转录因子。其中CSS0030706（命名为CsERF105）在摊放过程中表达显著上调，且与(Z)-3-己烯醇含量和CsADH1表达均呈显著正相关。
CsERF105调控CsADH1的分子机制研究表明，该转录因子能够直接结合CsADH1启动子，EMSA结果证实CsERF105特异性识别ERE顺式作用元件。双荧光素酶报告基因 assay显示CsERF105显著激活CsADH1启动子活性。茶树瞬时过表达实验证明，过表达CsERF105能够显著上调CsADH1表达并增加(Z)-3-己烯醇含量。
此外，外源乙烯利处理实验表明，乙烯可能通过激活CsERF105表达来促进CsADH1转录，进而增强(Z)-3-己烯醇的生物合成。这提示乙烯信号在调节茶叶特征香气形成中具有潜在作用。
本研究主要应用了以下关键技术方法：通过不同摊放程度的茶叶样品进行感官评价和挥发性成分分析；整合转录组测序与代谓组学分析筛选关键基因；利用体外酶活性测定验证CsADH1功能；采用酵母单杂交、双荧光素酶报告基因和电泳迁移率变动 assay研究蛋白-DNA相互作用；通过茶树瞬时转化技术进行体内功能验证；使用外源激素处理探讨信号调控机制。
研究结论表明，鲜叶摊放至水分含量68%-71%时最有利于六安瓜片清香特征的形成。(Z)-3-己烯醇在摊放过程中持续积累，且与该清香特征的形成密切相关。在(Z)-3-己烯醇生物合成途径中，CsADH1参与其在鲜叶摊放过程中的合成。乙烯响应转录因子CsERF105通过特异性结合CsADH1启动子中的ERE顺式作用元件，激活CsADH1转录。外源乙烯利处理揭示了乙烯信号在调节茶清香形成中的潜在作用。
该研究首次证实CsERF105-CsADH1模块在鲜叶摊放过程中响应脱水应激和潜在乙烯信号，从而调控(Z)-3-己烯醇的生物合成。这一发现开创性地将茶叶风味化学与分子生物学相结合，有助于深入揭示采后茶叶香气品质的调控机制，为在非生物胁迫下研究茶叶品质形成提供了新视角。该研究成果对优化绿茶加工工艺、精准调控茶叶香气品质具有重要理论指导意义，相关论文发表在《Journal of Advanced Research》期刊。
