《Plant Biotechnology Journal》：The PagDMG6341–PagWD40–PagPOLD4 Module Coordinates Base Excision Repair in ‘84K’ Poplar (Populus alba?×?P. glandulosa)
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本研究发现PagWD40作为支架蛋白连接DNA糖基化酶PagDMG6341和DNA聚合酶δ亚基PagPOLD4，在84K杨树中形成新型碱基切除修复（BER）复合体。通过转录组分析、蛋白互作验证和转基因功能研究，揭示了植物特异性DNA损伤修复网络的组织机制，为植物基因组稳定性维持提供了新见解。
1 引言
DNA在复制和传递过程中不可避免地遭受损伤，主要诱因包括内源性活性氧物种和外源性紫外线辐射等。碱基损伤是最常见的DNA损伤类型，其主要修复途径是碱基切除修复（BER）。BER分子机制涉及特异性DNA糖基化酶识别并切除受损碱基，随后招募修复蛋白完成缺口填充和连接。
BER途径第一步由具有高底物特异性的DNA糖基化酶启动，根据催化活性可分为单功能和双功能两类。单功能糖基化酶仅具有糖基化酶活性，而双功能糖基化酶还表现出AP裂解酶活性。在植物中，Pol δ和Pol ε被认为参与长片段BER（LP-BER），其中POLD4作为DNA聚合酶δ的调节亚基，在细胞增殖和基因组稳定性维持中起重要作用。
本研究以84K杨树为实验系统，应用低浓度5-氨基尿嘧啶（5-AU）诱导DNA碱基损伤。通过转录组分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA），鉴定出两个关键BER响应基因：DNA糖基化酶家族基因PagDMG6341和DNA聚合酶δ亚基PagPOLD4。
2 结果
2.1 5-氨基尿嘧啶诱导DNA损伤并触发动态基因表达
不同浓度5-AU在84K杨树细胞中诱导不同程度的DNA损伤。选择1.5 mM浓度进行实验，该浓度足以触发S期细胞阻滞同时诱导中等水平DNA损伤。实验设置六个时间点：两个在阻滞期（Ta和Tb），四个在释放期（Ha、Hb、Hc和Hd），每个时间点设有相应对照。
流式细胞术分析显示，在阻滞期和释放期均观察到S期和G2/M期细胞富集。转录组测序共获得36个样本，平均读长比对率为90.54%。主成分分析（PCA）证实生物学重复间高度一致，样本基于处理条件清晰分离。
模糊C均值聚类将差异表达基因（DEG）分为八个表达趋势：C2、C4、C6和C7显示整体下调，而C1、C3、C5和C8显示上调。基因本体（GO）富集分析显示C2与DNA修复过程相关，包括碱基切除和错配修复。
2.2 共表达网络分析与关键响应基因鉴定
WGCNA共识别10个共表达模块。聚类分析显示，黑色、红色、蓝色和棕色模块与G1期细胞比例呈正相关，而与S和G2期呈负相关。相反，黄色、洋红色、青绿色和绿色模块显示相反趋势。
棕色模块基因主要在阻滞期上调，释放期表达水平逐渐降低，这些基因主要富集于DNA修复、防御反应、转录调控和质膜组分相关功能。青绿色模块基因在释放期表达逐渐增加，富集于细胞周期调控因子以及DNA修复、防御反应、转录和细胞重塑相关基因。
共表达网络显示，棕色模块中四个DNA修复相关基因具有高连接性，其中三个是AT5G44680的剪接变体。青绿色模块中鉴定出两个DNA修复相关基因：POLD4和EXO1B。基于KEGG功能注释，聚焦AT5G44680和POLD4作为关键候选基因。
2.3 PagDMG6341和PagPOLD4的细胞类型特异性表达、亚细胞定位和蛋白序列分析
单细胞RNA-seq数据分析显示，PagDMG6341和PagPOLD4在增殖细胞簇中特异性表达。亚细胞定位实验表明，PagDMG6341-GFP和PagPOLD4-GFP融合蛋白定位于细胞核和质膜。蛋白序列比较显示，两种蛋白均具有高度序列保守性，PagDMG6341与单功能糖基化酶聚类，而PagPOLD4属于Pol δ家族。
2.4 PagDMG6341和PagPOLD4的功能沉默损害生长、不定根再生和5-AU耐受性
RNA干扰（RNAi）株系显示，与野生型（WT）相比，PagDMG6341-RNAi和PagPOLD4-RNAi株系的不定根发育显著延迟。移植45天后，RNAi株系在根形态和整株大小方面表现出显著差异。PagPOLD4-RNAi株系偶尔在异常位置产生不定根。
5-AU处理后，大多数RNAi株系对5-AU胁迫高度敏感。RT-qPCR分析显示，细胞周期基因和细胞壁重塑基因显著下调，而生长素调节基因表达无显著差异。
2.5 PagDMG6341和PagPOLD4在蛋白水平与PagWD40相互作用
酵母双杂交（Y2H）筛选发现，PagWD40与PagDMG6341和PagPOLD4均存在相互作用。AlphaFold3结构预测显示，PagDMG6341–PagWD40和PagPOLD4–PagWD40的ipTM + pTM值分别为1.10和1.32，表明高相互作用置信度。
酵母双杂交点对点 assay、双分子荧光互补（BiFC）和分裂荧光素酶互补（LCI）实验证实了这些相互作用。酵母三杂交（Y3H）实验进一步表明，PagWD40作为分子支架连接PagDMG6341和PagPOLD4形成功能复合体。
3 讨论
本研究首次提出PagDMG6341和PagPOLD4可能通过WD40型蛋白（PagWD40）功能协调，从而建立植物BER修复复合体的新模型。
3.1 PagDMG6341和PagPOLD4在84K杨树BER途径中的作用
5-AU作为嘧啶碱基类似物，主要在复制期间掺入DNA，导致碱基错配。PagDMG6341属于DNA糖基化酶超家族，在BER途径起始阶段发挥作用。其在5-AU处理S期阻滞阶段高表达，反映了对此类损伤的快速响应。
PagPOLD4属于DNA聚合酶δ家族，在LP-BER中发挥作用，特别是在AP位点缺口填充和末端切口密封中。其在释放期高表达与BER后期阶段的功能作用一致。
转基因株系功能验证表明，PagDMG6341和PagPOLD4在维持正常细胞DNA生理活动中起关键作用，证实它们在植物BER途径中的重要功能。
3.2 PagWD40桥接PagDMG6341和PagPOLD4调节BER途径
PagWD40作为转导蛋白/WD40重复样蛋白，以其重复WD二肽基序为特征。多个重复折叠成β-螺旋桨构型，为蛋白-蛋白相互作用和招募提供稳定而灵活的平台。
在动物中，WD40蛋白通常缺乏催化活性，但由于其高度模块化结构，常在大型多蛋白复合体中作为支架蛋白发挥作用。本研究表明，PagWD40作为分子桥连接PagDMG6341和PagPOLD4，有助于杨树中的BER。
4 结论
本研究鉴定了84K杨树BER途径中的两个关键基因PagDMG6341和PagPOLD4，它们在修复过程的不同阶段发挥作用。两者对正常生长、发育和基因组稳定性都至关重要。研究进一步揭示PagWD40作为支架蛋白连接PagDMG6341和PagPOLD4，从而在长片段BER中建立新的PagDMG6341–PagWD40–PagPOLD4模块。这项工作揭示了一种新的植物特异性DNA修复机制，扩展了WD40蛋白在基因组维持中的功能范围。
5 材料与方法
实验材料为84K杨树叶片外植体，培养于固体MS培养基。通过彗星实验评估DNA损伤，流式细胞术分析细胞周期分布。转录组测序使用36个样本，差异表达基因通过DESeq2识别。WGCNA用于构建共表达网络。通过农杆菌介导的转化获得RNAi转基因株系。蛋白相互作用通过Y2H、BiFC、LCI和Y3H实验验证。
